細(xì)胞生物學(xué)研究方法

03細(xì)胞生物學(xué)研究方法當(dāng)前1頁(yè)，總共70頁(yè)。第一節(jié)顯微技術(shù)光學(xué)顯微鏡：以可見(jiàn)光（或紫外線）為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。當(dāng)前2頁(yè)，總共70頁(yè)?！⒐鈱W(xué)顯微鏡當(dāng)前3頁(yè)，總共70頁(yè)。1.構(gòu)成：①照明系統(tǒng)②光學(xué)放大系統(tǒng)③機(jī)械裝置2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。（一）普通光學(xué)顯微鏡當(dāng)前4頁(yè)，總共70頁(yè)。當(dāng)前5頁(yè)，總共70頁(yè)。當(dāng)前6頁(yè)，總共70頁(yè)。3.分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。D=0.61λ/N*A其中λ為入射光線波長(zhǎng)；A為鏡口率＝sinα/2，

N介質(zhì)折射率；α=鏡口角（樣品對(duì)物鏡鏡口的張角）思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？當(dāng)前7頁(yè)，總共70頁(yè)。表一、幾種介質(zhì)的折射率當(dāng)前8頁(yè)，總共70頁(yè)。顯微鏡的幾個(gè)光學(xué)特點(diǎn)：制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。sinα/2的最大值必然小于1；介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。普通光線的波長(zhǎng)為400~700nm，分辨力數(shù)值不會(huì)小于0.2μm，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡的最大設(shè)計(jì)倍數(shù)為1000X。當(dāng)前9頁(yè)，總共70頁(yè)。（二）熒光顯微鏡FluorescencemicroscopeP53特點(diǎn)：光源為紫外線，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；有兩個(gè)特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。當(dāng)前10頁(yè)，總共70頁(yè)。當(dāng)前11頁(yè)，總共70頁(yè)。Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。當(dāng)前12頁(yè)，總共70頁(yè)。（三）激光共聚焦掃描顯微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSMP53用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途類(lèi)似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。當(dāng)前13頁(yè)，總共70頁(yè)。laserconfocalscanningmicroscope,LCSM當(dāng)前14頁(yè)，總共70頁(yè)。當(dāng)前15頁(yè)，總共70頁(yè)。LCSMImageofaXenopusMelanophore

當(dāng)前16頁(yè)，總共70頁(yè)。（四）暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。可觀察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。當(dāng)前17頁(yè)，總共70頁(yè)。把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處：環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。相位板（annularphaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。（五）相差顯微鏡P51當(dāng)前18頁(yè)，總共70頁(yè)。原理當(dāng)前19頁(yè)，總共70頁(yè)。用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本當(dāng)前20頁(yè)，總共70頁(yè)。（六）偏光顯微鏡polarizingmicroscope用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。光源前有偏振片（起偏器），使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（與起偏器方向垂直的偏振片）。載物臺(tái)是可以旋轉(zhuǎn)。淀粉當(dāng)前21頁(yè)，總共70頁(yè)。（七）微分干涉差顯微鏡

Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）P521952年，Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。當(dāng)前22頁(yè)，總共70頁(yè)。（八）倒置顯微鏡inversemicroscope物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有相差物鏡，有的還具有熒光裝置。

當(dāng)前23頁(yè)，總共70頁(yè)。（九）當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢(shì)采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體。自動(dòng)化與電子化。當(dāng)前24頁(yè)，總共70頁(yè)。二、電子顯微鏡P57（一）透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM當(dāng)前25頁(yè)，總共70頁(yè)。以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束的波長(zhǎng)短，并且波長(zhǎng)與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍。用于觀察超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure），即小于0.2μm、光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看清的結(jié)構(gòu)，又稱亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopicstructures）。1.原理當(dāng)前26頁(yè)，總共70頁(yè)。當(dāng)前27頁(yè)，總共70頁(yè)。透射電子顯微鏡TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM當(dāng)前28頁(yè)，總共70頁(yè)。表二、不同光線的波長(zhǎng)當(dāng)前29頁(yè)，總共70頁(yè)。2、制樣技術(shù)P571）超薄切片電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。當(dāng)前30頁(yè)，總共70頁(yè)。當(dāng)前31頁(yè)，總共70頁(yè)。2）負(fù)染技術(shù)P60用重金屬鹽(如磷鎢酸)對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸出的地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。NegativeStainedActin當(dāng)前32頁(yè)，總共70頁(yè)。3）冰凍蝕刻freeze-etchingP60亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開(kāi)，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來(lái)，此膜即為復(fù)膜（replica）。AYeastCell當(dāng)前33頁(yè)，總共70頁(yè)。20世紀(jì)60年代問(wèn)世，用來(lái)觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。分辨力為6~10nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個(gè)光點(diǎn)的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。（二）掃描電子顯微鏡SEMP62當(dāng)前34頁(yè)，總共70頁(yè)。Scanningelectronmicroscope（SEM）當(dāng)前35頁(yè)，總共70頁(yè)。工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)器收集，信號(hào)經(jīng)放大用來(lái)調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。當(dāng)前36頁(yè)，總共70頁(yè)。掃描電子顯微鏡原理當(dāng)前37頁(yè)，總共70頁(yè)。人類(lèi)紅細(xì)胞當(dāng)前38頁(yè)，總共70頁(yè)。酵母當(dāng)前39頁(yè)，總共70頁(yè)。人類(lèi)精子當(dāng)前40頁(yè)，總共70頁(yè)。（三）掃描隧道顯微鏡P63

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過(guò)程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向?yàn)?.1~0.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。當(dāng)前41頁(yè)，總共70頁(yè)。掃描隧道顯微鏡原理當(dāng)前42頁(yè)，總共70頁(yè)。STMimage,BenzenemoleculesaccumulateatstepedgesonCu當(dāng)前43頁(yè)，總共70頁(yè)。三、顯微操作技術(shù)

micromanipulationtechnique在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動(dòng)的機(jī)械裝置。顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，Gordon等人（1962）對(duì)非洲爪蟾進(jìn)行核移植獲得成功。我國(guó)著名學(xué)者童第周等上個(gè)世紀(jì)70年代在魚(yú)類(lèi)細(xì)胞核移植方面進(jìn)行了許多工作，并取得了豐碩成果。當(dāng)前44頁(yè)，總共70頁(yè)。顯微操作儀當(dāng)前45頁(yè)，總共70頁(yè)。第二節(jié)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)當(dāng)前46頁(yè)，總共70頁(yè)。組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法（histochemicalandcytochemicalstainingmethod）用于對(duì)某些細(xì)胞成分進(jìn)行定性和定位研究。（一）固定物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥?；瘜W(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類(lèi)多用甲醛丙酮緩沖液固定。當(dāng)前47頁(yè)，總共70頁(yè)。（二）顯示方法金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。Schiff反應(yīng)：細(xì)胞中的醛基可使Schiff試劑中的無(wú)色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）。聯(lián)苯胺反應(yīng)：過(guò)氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無(wú)色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類(lèi)而使脂類(lèi)顯色。茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。當(dāng)前48頁(yè)，總共70頁(yè)。二、免疫細(xì)胞化學(xué)immunocytochemistry根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。免疫熒光法（immunofluorescenttechnique）：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。酶標(biāo)免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）：常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。當(dāng)前49頁(yè)，總共70頁(yè)。三、顯微光譜分析技術(shù)細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線?？衫蔑@微分光光度計(jì)對(duì)某些成分進(jìn)行定位、定性和定量測(cè)定。當(dāng)前50頁(yè)，總共70頁(yè)。四、放射自顯影術(shù)用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。一般用14C和3H標(biāo)記。常用3H-TDR來(lái)顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。當(dāng)前51頁(yè)，總共70頁(yè)。五、分子雜交技術(shù)具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過(guò)氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來(lái)測(cè)定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。（一）原位雜交（insituhybridization）。用于檢測(cè)染色體上的特殊DNA序列。最初是使用帶放射性的DNA探針，后來(lái)又發(fā)明了免疫探針?lè)?。?dāng)前52頁(yè)，總共70頁(yè)。（二）Southern雜交是體外分析特異DNA序列的方法，操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過(guò)放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。當(dāng)前53頁(yè)，總共70頁(yè)。第三節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)當(dāng)前54頁(yè)，總共70頁(yè)。一、離心技術(shù)是分離細(xì)胞器（如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段。轉(zhuǎn)速為10~25kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機(jī)。目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心力超過(guò)500Kg。當(dāng)前55頁(yè)，總共70頁(yè)。（一）差速離心Differentialcentrifugation特點(diǎn)：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級(jí)離心。用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序：核——線粒體——溶酶體與過(guò)氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體——核蛋白體?？蓪⒓?xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過(guò)密度梯離心再行分離純化。當(dāng)前56頁(yè)，總共70頁(yè)。LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation當(dāng)前57頁(yè)，總共70頁(yè)。（二）密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。類(lèi)型：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；2）pH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時(shí)滲透壓不大；4）對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。當(dāng)前58頁(yè)，總共70頁(yè)。1、速度沉降velocitysedimentation用途：分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。當(dāng)前59頁(yè)，總共70頁(yè)。2.等密度沉降isopycnicsedimentation用途：分離密度不等的顆粒。特點(diǎn)：介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度。所需的力場(chǎng)通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速離心。原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的成分分離。當(dāng)前60頁(yè)，總共70頁(yè)。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation當(dāng)前61頁(yè)，總共70頁(yè)。二、流式細(xì)胞術(shù)用途：對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門(mén)技術(shù)。原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過(guò)高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)（flowcytometer）。當(dāng)前62頁(yè)，總共70頁(yè)。當(dāng)前63頁(yè)，總共70頁(yè)。第四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交一、細(xì)胞培養(yǎng)當(dāng)前64頁(yè)，總共70頁(yè)。（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)群體培養(yǎng)（massculture）：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層；克隆培養(yǎng)（clonalculture）：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆。當(dāng)前65頁(yè)，總共70頁(yè)。原代培養(yǎng)（primaryculture）即：培養(yǎng)直接來(lái)自動(dòng)物機(jī)體的細(xì)胞群，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。細(xì)胞株（cellstrain）：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。細(xì)胞系（cellline）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可無(wú)限繁殖?？寺。╟lone）：亦稱無(wú)性系。指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致