蛋白質(zhì)分離技術(shù)全演示文稿

蛋白質(zhì)分離技術(shù)全演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共141頁(yè)。優(yōu)選蛋白質(zhì)分離技術(shù)全當(dāng)前2頁(yè)，總共141頁(yè)。（一）分離純化的意義①?gòu)纳锊牧现蟹蛛x制備蛋白質(zhì)、核酸，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。②工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。③醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。④基因工程的需要當(dāng)前3頁(yè)，總共141頁(yè)。（二）分離純化的要求1、純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如作為研究一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達(dá)到一定純度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過(guò)程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。當(dāng)前4頁(yè)，總共141頁(yè)。（三）分離純化的一般程序生物大分子的分離純化一般可分為以下幾個(gè)階段：①材料的選擇和預(yù)處理②破碎細(xì)胞及提?。ㄓ袝r(shí)還需要進(jìn)行細(xì)胞器的分離）③分離純化：包括粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離其中前兩個(gè)階段為生物大分子分離純化的前處理。選擇材料破碎細(xì)胞提取分離純化分析及鑒定當(dāng)前5頁(yè)，總共141頁(yè)。二、蛋白質(zhì)（酶）

分離純化的前處理（一）材料的選擇與預(yù)處理選擇材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā９I(yè)生產(chǎn)上注意選擇含量高、來(lái)源豐富、易獲得、制備工藝簡(jiǎn)單、成本低的動(dòng)植物組織或微生物做原料?？蒲羞x材則無(wú)需考慮上述問(wèn)題，只要能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康募纯伞?shí)驗(yàn)材料選定后，常常需要進(jìn)行預(yù)處理，如動(dòng)物材料需要除去一些與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的結(jié)締組織、脂肪組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開(kāi)。另外，必須盡可能保持材料的新鮮，盡快加工處理。若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或加工，應(yīng)冷凍保存。當(dāng)前6頁(yè)，總共141頁(yè)。（二）細(xì)胞的破碎分離提取某一生物大分子，首先要求生物大分子從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來(lái)，并保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。但若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進(jìn)行組織細(xì)胞的破碎。組織細(xì)胞的破碎方法很多，不同的實(shí)驗(yàn)規(guī)模，不同的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)要求，使用的破碎方法和條件也不同。當(dāng)前7頁(yè)，總共141頁(yè)。1.

機(jī)械法：1)研磨：將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。2)組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，通常可先用家用食品加工機(jī)將組織打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)(即高速分散器)將組織的細(xì)胞打碎。當(dāng)前8頁(yè)，總共141頁(yè)。2.物理法：1)反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。2)超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時(shí)，時(shí)間要長(zhǎng)一些。3)壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa

的高壓下使細(xì)胞懸液通過(guò)一個(gè)小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。4)冷熱交替法：從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。當(dāng)前9頁(yè)，總共141頁(yè)。3.

化學(xué)與生物化學(xué)方法：1)自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，?xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)。2)溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。

3)酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細(xì)胞壁分解。4)有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。當(dāng)前10頁(yè)，總共141頁(yè)。（三）細(xì)胞器的分離細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，植物細(xì)胞還有葉綠體。如果要分離制備分布在這些細(xì)胞器中的生物大分子，為了防止其他細(xì)胞組分中的物質(zhì)對(duì)制備物的干擾或污染，還需先將細(xì)胞器分離出來(lái)，然后在某一細(xì)胞器中分離某一物質(zhì)。細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法，即將破碎后的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)行離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細(xì)胞組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過(guò)不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后，即可獲得所需組分。當(dāng)前11頁(yè)，總共141頁(yè)。（四）提取組織細(xì)胞破碎過(guò)程中，大量的胞內(nèi)酶及細(xì)胞內(nèi)含物被釋放出來(lái)，必須立即將其置于一定條件下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來(lái)的天然狀態(tài)，避免因長(zhǎng)久放置造成制備物的分解破壞，這就是提取。當(dāng)前12頁(yè)，總共141頁(yè)。1.影響提取的因素目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大小；由固相擴(kuò)散到液相的難易；溶劑的pH值和提取時(shí)間等。通常：極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑；溫度升高，溶解度加大；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。提取時(shí)所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。當(dāng)前13頁(yè)，總共141頁(yè)。2.水溶液提取蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。用水溶液提取生物大分子應(yīng)注意的幾個(gè)主要影響因素是：

1)鹽濃度（即離子強(qiáng)度）：離子強(qiáng)度對(duì)生物大分子的溶解度有極大的影響，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強(qiáng)度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時(shí)大大增加，稱為“鹽溶”現(xiàn)象。鹽溶現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動(dòng)，減少了偶極分子之間極性基團(tuán)的靜電吸引力，增加了溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果。為了提高提取效率，有時(shí)需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強(qiáng)度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性。當(dāng)前14頁(yè)，總共141頁(yè)。2)pH值：蛋白質(zhì)、酶的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關(guān)。過(guò)酸、過(guò)堿均應(yīng)盡量避免，一般控制在pH=6～8范圍內(nèi)，提取溶劑的pH應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點(diǎn)的兩側(cè)。3)溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時(shí)一般在0℃～5℃的低溫操作。

4)防止蛋白酶的降解作用：加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液的pH、離子強(qiáng)度或極性等方法使相應(yīng)的水解酶失去活性，防止它們對(duì)欲提純的蛋白質(zhì)、酶的降解作用。當(dāng)前15頁(yè)，總共141頁(yè)。5)攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會(huì)引起酶等物質(zhì)的變性失活。因?yàn)橐话愕鞍踪|(zhì)都含有相當(dāng)數(shù)量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團(tuán)，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過(guò)多都會(huì)使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或二硫蘇糖醇以防止巰基氧化。當(dāng)前16頁(yè)，總共141頁(yè)。3.有機(jī)溶劑提取

一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機(jī)溶劑提取。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時(shí)具有親水性和親脂性。有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機(jī)溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機(jī)溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐模⒓嬗谐ルs質(zhì)提高純化效果的作用。例如，胰島素。當(dāng)前17頁(yè)，總共141頁(yè)。4.膜蛋白的提取膜蛋白的種類繁多，多數(shù)膜蛋白分子數(shù)目較少，但卻賦予細(xì)胞膜非常重要的生物學(xué)功能。

根據(jù)膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式，膜蛋白可分為兩大類型：外周膜蛋白和內(nèi)在膜蛋白。

(1)外周膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度甚至提高溫度就可以從膜上分離下來(lái)，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。

(2)內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密，一般講只有用去垢劑(detergent)使膜溶解后才可分離出來(lái)。

當(dāng)前18頁(yè)，總共141頁(yè)。膜蛋白即內(nèi)在蛋白溶解性不好，提取膜蛋白的基本方法就是用不同的離心速度去掉胞質(zhì)蛋白等，最后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來(lái)。膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當(dāng)?shù)脑鋈苡帽砻婊钚詣?，一般常用的有膽酸鹽，Triton-100，Tween-80,SDS等表面活性劑。

當(dāng)前19頁(yè)，總共141頁(yè)。分離膜蛋白的方法（原則性）

1）

先分離膜，然后提取；如選用冷熱交替法、反復(fù)凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細(xì)胞破碎，然后通過(guò)剃度離心得到含有膜蛋白的粗組分。

2）用特殊的去污劑選擇性的分離。在多數(shù)情況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來(lái)。當(dāng)前20頁(yè)，總共141頁(yè)。當(dāng)前21頁(yè)，總共141頁(yè)。三、分離與純化從細(xì)胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步分離純化，這一階段可分為粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離兩步進(jìn)行。蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來(lái)的。當(dāng)前22頁(yè)，總共141頁(yè)。常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)溶解度鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀分子大小透析、超過(guò)濾密度梯度離心、凝膠過(guò)濾帶電特性電泳、離子交換層析吸附特性吸附層析對(duì)配體分子的親和性依據(jù)性質(zhì)方法用于粗分用于細(xì)分親和層析、金屬螯合層析分配層析當(dāng)前23頁(yè)，總共141頁(yè)。（一）粗分級(jí)分離主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開(kāi)。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)：分辨率低，產(chǎn)品雜質(zhì)多。當(dāng)前24頁(yè)，總共141頁(yè)。1.鹽析（中性鹽沉淀）在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過(guò)程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離。鹽析法應(yīng)用最廣的還是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點(diǎn)是：①成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。②操作簡(jiǎn)單、安全。③對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。當(dāng)前25頁(yè)，總共141頁(yè)。⑴鹽析的基本原理蛋白質(zhì)溶液為親水溶膠體系，其穩(wěn)定因素：水化膜和電荷。中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)分子的親水性。加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水溶膠，蛋白質(zhì)分子即聚集而形成沉淀。當(dāng)前26頁(yè)，總共141頁(yè)。溶解度鹽濃度Salting-outSalting-in當(dāng)前27頁(yè)，總共141頁(yè)。++++++++++++++++等點(diǎn)電時(shí)的蛋白質(zhì)（親水膠體）帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）脫水脫水脫水帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）不穩(wěn)定蛋白顆粒陰離子陽(yáng)離子堿酸酸蛋白質(zhì)聚集沉淀帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）堿++水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）水化膜當(dāng)前28頁(yè)，總共141頁(yè)。⑵中性鹽的選擇常用的中性鹽中最重要的是(NH4)2SO4，因?yàn)樗c其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點(diǎn)：

1)溶解度大：尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進(jìn)行。由下表可以看到，硫銨在0℃時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類：當(dāng)前29頁(yè)，總共141頁(yè)。幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）

0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3

103

Na2SO4

4.918.943.342.2

NaH2PO41.67.893.8

101硫銨在0℃時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類當(dāng)前30頁(yè)，總共141頁(yè)。2)分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純度提高了四倍。

3)不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用2～3mol/L濃度的(NH4)2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久。

4)價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境。當(dāng)前31頁(yè)，總共141頁(yè)。（3）分段鹽析不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出飽和度：在給定條件下以可能達(dá)到的最大濃度的百分?jǐn)?shù)表示的鹽濃度。當(dāng)前32頁(yè)，總共141頁(yè)。當(dāng)前33頁(yè)，總共141頁(yè)。（4）鹽析的影響因素1)蛋白質(zhì)的濃度：高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質(zhì)濃度過(guò)高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質(zhì)濃度是2.5％～3.0％，相當(dāng)于25mg/mL～30mg/mL。2)pH值對(duì)鹽析的影響：在等電點(diǎn)處溶解度小，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。3)溫度的影響：對(duì)于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強(qiáng)度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強(qiáng)度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨溫度升高而增加的。一般情況下，可在室溫下進(jìn)行。但對(duì)于某些對(duì)溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失。

當(dāng)前34頁(yè)，總共141頁(yè)。2.有機(jī)溶劑沉淀法⑴基本原理

有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：①降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。②由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)，從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。當(dāng)前35頁(yè)，總共141頁(yè)。（2）有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。②沉淀不用脫鹽，過(guò)濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機(jī)溶劑）。因而在生化制備中有廣泛的應(yīng)用。其缺點(diǎn)是對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。當(dāng)前36頁(yè)，總共141頁(yè)。（3）有機(jī)溶劑的選擇和濃度的計(jì)算

用于生化制備的有機(jī)溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。為了獲得沉淀而不著重于進(jìn)行分離，可用溶液體積的倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機(jī)溶劑，來(lái)進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀。當(dāng)前37頁(yè)，總共141頁(yè)。（4）有機(jī)溶劑沉淀的影響因素

1)溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感，溫度稍高就會(huì)引起變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此必須預(yù)冷，操作要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時(shí)必須緩慢且不斷攪拌以免局部過(guò)濃。一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。

2)樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用比例更大的有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀。高濃度樣品，可以節(jié)省有機(jī)溶劑，減少變性的危險(xiǎn)，但雜蛋白的共沉淀作用大。通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為宜。

當(dāng)前38頁(yè)，總共141頁(yè)。3)pH值：選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，通常是選在等電點(diǎn)附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。4)離子強(qiáng)度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超過(guò)5％為宜，使用乙醇的量也以不超過(guò)原蛋白質(zhì)水溶液的２倍體積為宜，少量的中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)變性有良好的保護(hù)作用，但鹽濃度過(guò)高會(huì)增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。

沉淀所得的固體樣品，如果不是立即溶解進(jìn)行下一步的分離，則應(yīng)盡可能抽干沉淀，減少其中有機(jī)溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機(jī)溶劑，以免影響樣品的生物活性。當(dāng)前39頁(yè)，總共141頁(yè)。3.等電點(diǎn)沉淀法利用具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，在達(dá)到電中性時(shí)溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離。由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。當(dāng)前40頁(yè)，總共141頁(yè)。pH和離子強(qiáng)度對(duì)β-乳球蛋白溶解度的影響當(dāng)前41頁(yè)，總共141頁(yè)。4.選擇性變性沉淀法這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純。

⑴

熱變性

利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。

⑵

表面活性劑和有機(jī)溶劑變性使那些對(duì)表面活性劑和有機(jī)溶劑敏感性強(qiáng)的雜蛋白變性沉淀。通常在冰浴或冷室中進(jìn)行。

⑶

選擇性酸堿變性

利用對(duì)pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀。通常是在分離純化流程中附帶進(jìn)行的分離純化步驟。當(dāng)前42頁(yè)，總共141頁(yè)。5.有機(jī)聚合物沉淀法有機(jī)聚合物是六十年代發(fā)展起來(lái)的一類重要的沉淀劑，最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒。近年來(lái)廣泛用于核酸和酶的純化。其中應(yīng)用最多的是“聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)】(PolyethyleneGlycol簡(jiǎn)寫(xiě)為

PEG)，它的親水性強(qiáng)，溶干水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的

PEG。

本方法的優(yōu)點(diǎn)是：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。③沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。當(dāng)前43頁(yè)，總共141頁(yè)。6.透析自ThomasGraham1861年發(fā)明透析方法至今已有一百多年。透析已成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室最簡(jiǎn)便最常用的分離純化技術(shù)之一。在生物大分子的制備過(guò)程中，除鹽、除少量有機(jī)溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析的技術(shù)。透析只需要使用專用的半透膜即可完成。當(dāng)前44頁(yè)，總共141頁(yè)。保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保留液”，袋（膜）外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。截留分子量MwCO通常為1萬(wàn)左右。用1％

BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1％

AgNO3

檢查NaCl、KCl等。當(dāng)前45頁(yè)，總共141頁(yè)。7.超濾超過(guò)濾即超濾，自20年代問(wèn)世后，直至60年代以來(lái)發(fā)展迅速，很快由實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的分離手段發(fā)展成重要的工業(yè)單元操作技術(shù)。超濾現(xiàn)已成為一種重要的生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)，廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子（如蛋白質(zhì)、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化。超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過(guò)，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。當(dāng)前46頁(yè)，總共141頁(yè)。加壓的蛋白質(zhì)溶液濃縮的蛋白質(zhì)溶液含小分子的溶液當(dāng)前47頁(yè)，總共141頁(yè)。超濾根據(jù)所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過(guò)濾、超濾和反滲透三種。

微孔過(guò)濾所用的操作壓通常小于4×104Pa，膜的平均孔徑為500?！?4微米（1微米＝104埃），用于分離較大的微粒、細(xì)菌和污染物等。超濾所用操作壓為4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔徑為10—100埃，用于分離大分子溶質(zhì)。反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達(dá)到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔徑最小，一般為10埃以下，用于分離小分子溶質(zhì)，如海水脫鹽，制高純水等。當(dāng)前48頁(yè)，總共141頁(yè)。（二）精分級(jí)分離一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級(jí)后，體積較小，雜質(zhì)大部分被除去。進(jìn)一步提純，通常使用高分辨率的柱層析及電泳方法。常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析和金屬螯合層析等。常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳等。另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。當(dāng)前49頁(yè)，總共141頁(yè)。第十節(jié)蛋白質(zhì)的分離與純化一、引言二、蛋白質(zhì)（酶）分離純化的前處理三、蛋白質(zhì)（酶）分離與純化四、層析技術(shù)五、電泳技術(shù)六、離心技術(shù)當(dāng)前50頁(yè)，總共141頁(yè)。四、層析技術(shù)層析法也稱色譜法，是1906年俄國(guó)植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過(guò)裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開(kāi)，由此得名為“色譜法”（Chromatography)。后來(lái)無(wú)色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。1944年出現(xiàn)紙層析。以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。當(dāng)前51頁(yè)，總共141頁(yè)。（一）層析的分類按層析的分離機(jī)理分類排阻層析(exclusionchromatography)離子交換層析(ionexchangechromatography)吸附層析(absorptionchromatography)分配層析(partitionchromatography)親和層析(affinitychromatography)金屬螯合層析(metalchelatingchromatography)疏水層析(hydrophobicchromatography)反向?qū)游?reversephasechromatography)聚焦層析(focusingchromatography)灌注層析(perfusionchromatography)當(dāng)前52頁(yè)，總共141頁(yè)。（二）排阻層析（凝膠層析）凡是利用生物大分子的相對(duì)分子質(zhì)量差異進(jìn)行層析分離的方法，均稱之為排阻層析。用于層析的分離介質(zhì)稱為排阻層析介質(zhì)。凝膠層析介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過(guò)特殊工藝合成的層析介質(zhì)。目前已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物制藥的研究和生產(chǎn)中必不可少的分離介質(zhì)。當(dāng)前53頁(yè)，總共141頁(yè)。1、凝膠層析的特點(diǎn)及應(yīng)用特點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、特別是不改變樣品生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)。用途：蛋白質(zhì)(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時(shí)還應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定、脫鹽、樣品濃縮等。當(dāng)前54頁(yè)，總共141頁(yè)。2、凝膠層析的原理凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。概念（排阻層析，分子篩層析）：當(dāng)生物大分子通過(guò)裝有凝膠顆粒的層析柱時(shí)，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過(guò)層析柱時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來(lái)；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過(guò)的路程較長(zhǎng)移動(dòng)速度較慢，最后被洗脫出來(lái)。當(dāng)前55頁(yè)，總共141頁(yè)。當(dāng)前56頁(yè)，總共141頁(yè)。當(dāng)前57頁(yè)，總共141頁(yè)。3.凝膠的種類和性質(zhì)(1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex)1)SephadexGG后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。

G反應(yīng)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。

2）SephadeXLH—20，是SephadexG—25的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。(2)瓊脂糖凝膠（Sepharose;pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)

依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。(3)聚丙烯酰胺一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。商品名為生物膠—P（Bio-GelP).(4)

聚丙乙烯凝膠（Styrogel)大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。當(dāng)前58頁(yè)，總共141頁(yè)。葡聚糖凝膠(Sephadex)的物理特性品名干膠顆粒直徑/μm得水值Wf/g.g-1床體積/mL.g-1最適分段分離范圍溶脹所需時(shí)間/h最大流體靜力壓/Pa(cmH2O)球蛋白分子質(zhì)量／Da線性葡聚糖分子質(zhì)量/Da20℃lOO℃SephadexG-1O40-1201.0±0.12-370070031>9810(100)SephadexG-1540-1201.5±0.22.5-3.51500150031>9810(100)SephadexG-25粗中粗細(xì)超細(xì)100-30050-15020-8010-402.5±0.24-61000-5000100-500062>9810(100)SephadexG-50粗中粗細(xì)超細(xì)100-30050-15020-8010-405.0±0.39-111500-30000500-1000062>9810(100)SephadexG-75中粗超細(xì)40-12010-407.5±0.512-153000-700001000-500002434905(50)SephdexG-100中粗超細(xì)40-12010-4010±l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)SephadexG-150中粗超細(xì)40-12010-4015±1.520-305000-4000001000-1500007251472(15)SephadexG-200中粗超細(xì)40-12010-4020±2.030-405000-8000001000-200000725981(10)當(dāng)前59頁(yè)，總共141頁(yè)。4.層析柱的重要參數(shù)

⑴柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt表示。

⑵外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。當(dāng)前60頁(yè)，總共141頁(yè)。⑶內(nèi)水體積：因?yàn)槟z為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。不包括固體支持物的體積（Vg）。

⑷峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過(guò)凝膠柱所需洗脫液的體積，常用Ve表示。當(dāng)使用樣品的體積很少時(shí)，（與洗脫體積比較可以忽略不計(jì)），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當(dāng)樣品很大時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從應(yīng)用樣品開(kāi)始到洗脫峰升高的彎曲點(diǎn)（或半高處）。

當(dāng)前61頁(yè)，總共141頁(yè)。洗脫體積當(dāng)前62頁(yè)，總共141頁(yè)。5.凝膠過(guò)濾在試驗(yàn)室中的應(yīng)用1）生物大分子物質(zhì)的分離純化2）分子量的測(cè)定3）分級(jí)分離4）溶液濃縮5）平衡常數(shù)的測(cè)定6）細(xì)胞及顆粒的分離當(dāng)前63頁(yè)，總共141頁(yè)。6.分子量的測(cè)定蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān):LogM=k1-k2Ve（Ve為洗脫體積）先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)Ve作圖得一直線，再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。LogMABCLogM測(cè)V測(cè)當(dāng)前64頁(yè)，總共141頁(yè)。（三）離子交換層析根據(jù)離子交換樹(shù)脂對(duì)需要分離的各種離子的親和力不同而達(dá)到分離的目的。離子交換樹(shù)脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，分子中含有可解離的基團(tuán)。含有酸性可解離基團(tuán)的稱為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，可解離出H+；含有堿性可解離基團(tuán)的稱為陰離子交換樹(shù)脂，可解離出OH-。當(dāng)前65頁(yè)，總共141頁(yè)。1.離子交換層析的原理

生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等多價(jià)電解質(zhì)有不同的分子大小及電荷排列方式。當(dāng)在一定pH下凈電荷為負(fù)的蛋白質(zhì)分子可通過(guò)靜電鍵結(jié)合到帶正電荷的陰離子交換劑上；當(dāng)在一定pH下凈電荷為正的蛋白質(zhì)分子可通過(guò)靜電鍵結(jié)合到帶負(fù)電荷的陽(yáng)離子交換劑上；大分子依其與離子交換劑親和力的不同，而在以不同牢度被吸附于離子交換劑，通過(guò)改變離子強(qiáng)度或(和)pH使大分子再?gòu)碾x子交換劑上先后被洗脫下來(lái)。當(dāng)前66頁(yè)，總共141頁(yè)。當(dāng)前67頁(yè)，總共141頁(yè)。2.離子交換層析的應(yīng)用1)水處理離子交換層析是一種簡(jiǎn)單而有效的雜質(zhì)及各種離子的方法，聚丙乙烯樹(shù)脂廣泛的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面。2)分離純化小分子物質(zhì)離子交換層析廣泛應(yīng)用于無(wú)機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化。例如對(duì)氨基酸的分析使用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子聚苯乙烯樹(shù)脂，將氨基酸混合液在pH值為2～3上柱。這時(shí)氨基酸都結(jié)合在樹(shù)脂上，再逐步提高洗脫液的離子強(qiáng)度和pH值，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來(lái)，可以進(jìn)行分離鑒定。全自動(dòng)氨基酸分析儀就是采用這種原理制成。當(dāng)前68頁(yè)，總共141頁(yè)。3)分離純化生物大分子物質(zhì)離子交換層析是依據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)的不同來(lái)進(jìn)行分離純化的，是分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子的一種重要手段。由于生物樣品的復(fù)雜性，一般很難只經(jīng)過(guò)一次離子交換層析就達(dá)到高純度，往往要與其它分離方法結(jié)合使用。使用離子交換層析分離樣品要充分利用其按帶電性質(zhì)來(lái)分離的特性，只要選擇合適的條件，通過(guò)離子交換層析可以得到較滿意的分離效果。當(dāng)前69頁(yè)，總共141頁(yè)。（四）吸附層析

(absorptionchromatography)吸附作用是指某些物質(zhì)能夠從溶液中將溶質(zhì)濃集在其表面的現(xiàn)象。利用吸附層析介質(zhì)表面的活性分子或活性基團(tuán)，對(duì)流動(dòng)相中不同溶質(zhì)產(chǎn)生吸附作用，利用其對(duì)不同溶質(zhì)吸附能力的強(qiáng)弱而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為吸附層析。固定相為固體，流動(dòng)相為液體。當(dāng)前70頁(yè)，總共141頁(yè)。物質(zhì)之所以能在固體表面停留，這是因?yàn)楣腆w表面的分子和固體內(nèi)部分子所受的吸引力不同。在固體內(nèi)部，分子之間互相作用的力是對(duì)稱的，其力場(chǎng)互相抵消。而處于固體表明的分子所收的力是不對(duì)稱的，向內(nèi)的一面受到固體內(nèi)部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質(zhì)分子在運(yùn)動(dòng)中遇到固體表面時(shí)受到這種剩余力的影響，就會(huì)被吸引而停留下來(lái)。吸附過(guò)程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來(lái)。在單位時(shí)間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時(shí)間內(nèi)離開(kāi)此表面的分子之間可以建立動(dòng)態(tài)平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過(guò)程就是不斷地產(chǎn)生平衡和不平衡、吸附與解吸的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。當(dāng)前71頁(yè)，總共141頁(yè)。實(shí)驗(yàn)中常用的固體吸附劑有氧化鋁、硅酸鎂、磷酸鈣、氫氧化鈣、活性鈣、蔗糖、纖維素和淀粉。常用的洗脫液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙醇、丙酮或水與有機(jī)溶劑形成的各種混合物。吸附層析通常用于分離脂類、類固醇類、類胡羅卜素、葉綠素以及它們的前體等非極性和極性不強(qiáng)的有機(jī)物。

當(dāng)前72頁(yè)，總共141頁(yè)。（五）分配層析

(partitionchromatography)分配層析是利用混合物中各組分在兩相中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的的層析技術(shù)，相當(dāng)于一種連續(xù)性的溶劑抽提方法。

在分配層析中，固定相是極性溶劑（例如水、稀硫酸、甲醇等）。此類溶劑能和多孔的支持物(常用的是吸附力小、反應(yīng)性弱的惰性物質(zhì)如淀粉、纖維素粉，濾紙等)緊密結(jié)合，使呈不流動(dòng)狀態(tài)；流動(dòng)相則是非極性的有機(jī)溶劑。

當(dāng)前73頁(yè)，總共141頁(yè)。分配系數(shù)(α)是指在一定溫度和壓力條件下達(dá)到平衡，物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相兩部分的濃度比值。

分配系數(shù)（α）＝物質(zhì)在固定相中的濃度物質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度當(dāng)前74頁(yè)，總共141頁(yè)。在層析過(guò)程中，當(dāng)有機(jī)溶劑流動(dòng)相流經(jīng)樣品點(diǎn)時(shí)，樣品中的溶質(zhì)便按其分配系數(shù)部分地轉(zhuǎn)入流動(dòng)相向前移動(dòng)。當(dāng)經(jīng)過(guò)前方固定相時(shí)，流動(dòng)相中的溶質(zhì)就會(huì)進(jìn)行分配，一部分進(jìn)入固定相。通過(guò)這樣不斷進(jìn)行的流動(dòng)和再分配，溶質(zhì)沿著流動(dòng)方向不斷前進(jìn)。各種溶質(zhì)由于分配系數(shù)不同，向前移動(dòng)的速度也各不相同。分配系數(shù)較大的物質(zhì)，由于分配在固定相多些，分配在流動(dòng)相少些，溶質(zhì)移動(dòng)較慢；而分配系數(shù)較小的物質(zhì)，流動(dòng)速度較快。從而將分配系數(shù)不同的物質(zhì)分離開(kāi)來(lái)。當(dāng)前75頁(yè)，總共141頁(yè)。當(dāng)前76頁(yè)，總共141頁(yè)。（六）親和層析

(AffinityChromatography)

許多物質(zhì)都具有和某化合物發(fā)生特異性可逆結(jié)合的特性。例如：酶與輔酶或酶與底物（產(chǎn)物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑等），抗原與抗體，凝集素與受體，維生素與結(jié)合蛋白，凝集素與多糖（或糖蛋白、細(xì)胞表面受體），核酸與互補(bǔ)鏈（或組蛋白、核酸多聚酶、結(jié)合蛋白）以及細(xì)胞與細(xì)胞表面特異蛋白（或凝集素）等。

當(dāng)前77頁(yè)，總共141頁(yè)。1.親和層析的原理親和層析法就是利用化學(xué)方法將可與待分離物質(zhì)可逆性特異結(jié)合的化合物（稱配體）連接到某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當(dāng)待提純的生物大分子通過(guò)此層析柱時(shí)，此生物大分子便與載體上的配體特異的結(jié)合而留在柱上，其他物質(zhì)則被沖洗出去。然后再用適當(dāng)方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下來(lái)，從而達(dá)到分離提純的目的。當(dāng)前78頁(yè)，總共141頁(yè)。配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物交聯(lián)試劑載體配體載體與配體交聯(lián)體雜質(zhì)雜質(zhì)游離配體當(dāng)前79頁(yè)，總共141頁(yè)。當(dāng)前80頁(yè)，總共141頁(yè)。2.親和層析的特點(diǎn)純化效率極高：親和層析由于配體與待分離物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合，所以分離提純的效率極高，提純度可達(dá)幾千倍。當(dāng)前81頁(yè)，總共141頁(yè)。3.親和層析的應(yīng)用1）抗原和抗體

利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進(jìn)行分離的方法又稱為免疫親和層析。例如將抗原結(jié)合于親和層析基質(zhì)上，就可以從血清中分離其對(duì)應(yīng)的抗體?？乖⒖贵w間親和力一般比較強(qiáng)，其解離常數(shù)為10–8-10–12M，所以洗脫時(shí)是比較困難的，通常需要較強(qiáng)烈的洗脫條件。當(dāng)前82頁(yè)，總共141頁(yè)。2)激素和受體蛋白

激素的受體蛋白屬于膜蛋白，利用去污劑溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性質(zhì)，難于用通常的層析技術(shù)分離。但去污劑溶解通常不影響受體蛋白與其對(duì)應(yīng)激素的結(jié)合。所以利用激素和受體蛋白間的高親和力（10-6－10–12M）而進(jìn)行親和層析是分離受體蛋白的重要方法。目前已經(jīng)用親和層析方法純化出了大量的受體蛋白，如乙酰膽堿、腎上腺素、生長(zhǎng)激素、嗎啡、胰島素等等多種激素的受體。當(dāng)前83頁(yè)，總共141頁(yè)。3)凝集素和糖蛋白

凝集素是一類具有多種特性的糖蛋白，幾乎都是從植物中提取。它們能識(shí)別特殊的糖，因此可以用于分離多糖、各種糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的細(xì)胞。用凝集素作為配體的親和層析是分離糖蛋白的主要方法。

伴刀豆球蛋白A能結(jié)合含α-D-吡喃甘露糖苷或α-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白。

麥胚凝集素可以特異的與N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神經(jīng)氨酸結(jié)合，可以用于血型糖蛋白A、紅細(xì)胞膜凝集素受體等的分離。洗脫時(shí)只需用相應(yīng)的單糖或類似物，就可以將待分離的糖蛋白洗脫下來(lái)。當(dāng)前84頁(yè)，總共141頁(yè)。4）多核苷酸和核酸

利用poly-U作為配體可以用于分離mRNA以及各種poly-U結(jié)合蛋白。poly-A可以用于分離RNA聚合酶以及其它poly-A結(jié)合蛋白。以DNA作為配體可以用于分離各種DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多種酶類。5）輔酶

核苷酸及其許多衍生物、各種維生素等是多種酶的輔酶或輔助因子，利用它們與對(duì)應(yīng)酶的親和力可以對(duì)多種酶類進(jìn)行分離純化。例如固定的各種腺嘌呤核苷酸輔酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等應(yīng)用很廣泛，可以用于分離各種激酶和脫氫酶。當(dāng)前85頁(yè)，總共141頁(yè)。6）分離病毒、細(xì)胞

利用配體與病毒、細(xì)胞表面受體的相互作用，親和層析也可以用于病毒和細(xì)胞的分離。利用凝集素、抗原、抗體等作為配體都可以用于細(xì)胞的分離。例如各種凝集素可以用于分離紅細(xì)胞以及各種淋巴細(xì)胞，胰島素可以用于分離脂肪細(xì)胞等。當(dāng)前86頁(yè)，總共141頁(yè)。（七）金屬螯合層析

(metalchelatingchromatography)利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基與二價(jià)金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，二價(jià)金屬離子可以與流動(dòng)相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合作用而進(jìn)行分離的方法，稱之為金屬螯合層析。當(dāng)前87頁(yè)，總共141頁(yè)。金屬螯合層析技術(shù)在現(xiàn)代基因工程中常用于表達(dá)蛋白的分離NH2NH2NiHisHisHisHisprotein▁▁▁▂▃▄▅▆▇▇▆▅▄▃▂▁▁▁▁▂▃▄▅▆▇▇▆▅▄▃▂▁當(dāng)前88頁(yè)，總共141頁(yè)。（八）高效液相色譜（HPLC）高效液相色譜法是以液體作為流動(dòng)相，用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。高效液相色譜對(duì)樣品的適用性廣，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來(lái)分析。當(dāng)前89頁(yè)，總共141頁(yè)。1.高效液相色譜法的特點(diǎn)特點(diǎn)：高壓、高效、高速高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。當(dāng)前90頁(yè)，總共141頁(yè)。2.液相色譜儀、主要部件及流程當(dāng)前91頁(yè)，總共141頁(yè)。當(dāng)前92頁(yè)，總共141頁(yè)。主要部件(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。當(dāng)前93頁(yè)，總共141頁(yè)。(2)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。當(dāng)前94頁(yè)，總共141頁(yè)。(3)進(jìn)樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：當(dāng)前95頁(yè)，總共141頁(yè)。(4)高效分離柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。當(dāng)前96頁(yè)，總共141頁(yè)。(5)高效液相色譜檢測(cè)器紫外光度檢測(cè)器（UV）：最小檢測(cè)量10-9g·mL-1，對(duì)流量和溫度的波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫。最常用的檢測(cè)器。當(dāng)前97頁(yè)，總共141頁(yè)。光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。當(dāng)前98頁(yè)，總共141頁(yè)。3.影響分離的因素影響分離的主要因素有:

固定相及分離柱；流動(dòng)相的流量、性質(zhì)和極性;

當(dāng)前99頁(yè)，總共141頁(yè)。1）固定相及分離柱選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。選擇短柱、細(xì)內(nèi)徑提高分析速度；研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。當(dāng)前100頁(yè)，總共141頁(yè)。2）流動(dòng)相及流動(dòng)相的極性（1）可顯著改變組分分離狀況的流動(dòng)相選擇在液相色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。當(dāng)前101頁(yè)，總共141頁(yè)。流動(dòng)相組成流動(dòng)相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑:

己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。當(dāng)前102頁(yè)，總共141頁(yè)。4.高效液相色譜法的主要分離類型1）吸附色譜（液-固吸附色譜）以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2）分配色譜（液-液分配色譜）早期通過(guò)在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過(guò)化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔(dān)體表面。當(dāng)前103頁(yè)，總共141頁(yè)。3）離子交換色譜固定相為離子交換樹(shù)脂，流動(dòng)相為無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹(shù)脂上的交換基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。4）凝膠色譜（空間排阻色譜）以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠；當(dāng)前104頁(yè)，總共141頁(yè)。五、電泳技術(shù)電泳的概念：帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國(guó)物理學(xué)家Re?ss進(jìn)行了世界上第一次電泳實(shí)驗(yàn)）。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進(jìn)行紙電泳以后，特別是近幾十年以來(lái)，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。當(dāng)前105頁(yè)，總共141頁(yè)。電泳技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史

1809年俄國(guó)物理學(xué)家Рейсе首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。他在濕粘土中插上帶玻璃管的正負(fù)兩個(gè)電極，加電壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原有的水層變混濁，即帶負(fù)電荷的粘土顆粒向正極移動(dòng)，這就是電泳現(xiàn)象。

1909年Michaelis首次將膠體離子在電場(chǎng)中的移動(dòng)稱為電泳。他用不同pH的溶液在U形管中測(cè)定了轉(zhuǎn)化酶和過(guò)氧化氫酶的電泳移動(dòng)和等電點(diǎn)。

當(dāng)前106頁(yè)，總共141頁(yè)。1937年瑞典Uppsala大學(xué)的Tiselius對(duì)電泳儀器作了改進(jìn)，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動(dòng)界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的開(kāi)拓性貢獻(xiàn)而獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

1948年Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對(duì)氨基酸的分離進(jìn)行過(guò)研究。1950年Durrum用紙電泳進(jìn)行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開(kāi)創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。當(dāng)前107頁(yè)，總共141頁(yè)。

1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開(kāi)創(chuàng)了近代電泳的新時(shí)代。30多年來(lái)，聚丙烯酰胺凝膠電泳仍是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鑒定技術(shù)，是檢驗(yàn)生化物質(zhì)的最高純度：即“電泳純”（一維電泳一條帶或二維電泳一個(gè)點(diǎn)）的標(biāo)準(zhǔn)分析鑒定方法，至今仍被人們稱為是對(duì)生物大分子進(jìn)行分析鑒定的最后、最準(zhǔn)確的手段，即“LastCheck”。80年代發(fā)展起來(lái)的新的毛細(xì)管電泳技術(shù)，是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視和應(yīng)用。當(dāng)前108頁(yè)，總共141頁(yè)。（一）電泳的分類原則上按電泳的原理來(lái)分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動(dòng)界面電泳，是指在沒(méi)有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過(guò)程中的對(duì)流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。當(dāng)前109頁(yè)，總共141頁(yè)。按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤(pán)球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒(méi)有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。當(dāng)前110頁(yè)，總共141頁(yè)。③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測(cè)）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號(hào)之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時(shí)間長(zhǎng)，操作麻煩，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少使用。④瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。⑤聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)當(dāng)前111頁(yè)，總共141頁(yè)。（二）電泳的基本原理電泳是在電場(chǎng)的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運(yùn)動(dòng)，不同的物質(zhì)在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，由于所帶電荷不同，因此受到的引力不同，向相反電極泳動(dòng)速度不同進(jìn)而達(dá)到分離目的。當(dāng)前112頁(yè)，總共141頁(yè)。若將帶凈電荷Q的粒子放入電場(chǎng)，則該粒子所受到的電荷引力為：

F引=EQ（1）在溶液中,運(yùn)動(dòng)粒子與溶液之間存在阻力F阻

F阻=6πrηV

當(dāng)F引=F阻時(shí)

EQ=6πrηV

V=

由上式可以看出,粒子的移動(dòng)速度(泳動(dòng)速度V)與電場(chǎng)強(qiáng)度(E)和粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度(η)成反比。非球形分子（如線狀DNA）在電泳過(guò)程中受到更大的阻力，即粒子的泳動(dòng)速度與粒子形狀有關(guān)。EQ6πrη（2）（3）（4）當(dāng)前113頁(yè)，總共141頁(yè)。由（4）可知，帶電粒子的泳動(dòng)速度受電場(chǎng)強(qiáng)度影響，使得同一種帶電粒子在不同電場(chǎng)里泳動(dòng)速度不同。在一次電泳中，蛋白質(zhì)處在同一電場(chǎng)中，為了便于比較，常用遷移率m（或稱泳動(dòng)度，指帶電粒子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度）代替泳動(dòng)速度表示粒子的泳動(dòng)情況。

m=V/E=Q/6πrη

（5）

由上式可以看出，在同一電場(chǎng)中，遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)量、粒子大小及溶液粘度有關(guān)，而與電場(chǎng)強(qiáng)度無(wú)關(guān)。EQ6πrη（4）V=當(dāng)前114頁(yè)，總共141頁(yè)。

以上討論的是在溶液中進(jìn)行的自由界面電泳的情況，在用支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受電滲（是指在電場(chǎng)中，液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)）的影響。電泳時(shí)應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。最后要考慮選用離子強(qiáng)度適宜的溶液。離子強(qiáng)度影響粒子的電動(dòng)電勢(shì)，溶液的離子強(qiáng)度越高，由于溶液中的離子會(huì)分擔(dān)大部分電流，則粒子的電動(dòng)電勢(shì)越小，泳動(dòng)速度越慢，反之越快。

總之，電泳受粒子本身大小、形狀、所帶電量、溶液粘度、溫度、pH、電滲及離子強(qiáng)度多種因素的影響。當(dāng)前115頁(yè)，總共141頁(yè)。（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度變化小，沒(méi)有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡(jiǎn)稱Bis）在催化劑作用下合成的。聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。當(dāng)前116頁(yè)，總共141頁(yè)。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,

N’-甲叉雙丙烯酰胺CH2=CH

C=ONHCH2NHC=O

CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH

C=ONHCH2NHC=O

CH2-CHCH2ˉ

CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m當(dāng)前117頁(yè)，總共141頁(yè)。1.聚丙烯酰胺凝膠的制備聚丙烯酰胺凝膠聚合為自由基聚合，其催化體系有兩種：

1.化學(xué)聚合化學(xué)聚合的催化劑（引發(fā)劑）通常采用過(guò)硫酸銨（ammoniumpersulfate，Ap），此外還需要加速劑TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可促使過(guò)硫酸銨形成自由基：

S2O82-2?SO4-

這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。當(dāng)前118頁(yè)，總共141頁(yè)。2.光聚合

光聚合通常用核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無(wú)色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在，可以加速聚合。上述聚合反應(yīng)受許多因素的影響：

（1）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長(zhǎng)的增加。在進(jìn)行化學(xué)聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。

（2）低溫、低pH都會(huì)減慢聚合反應(yīng)速度。

（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機(jī)玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應(yīng)。當(dāng)前119頁(yè)，總共141頁(yè)。2.

凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系凝膠的物理性質(zhì)如機(jī)械強(qiáng)度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（T）和Acr與Bis兩者之比。凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）的計(jì)算公式分別為：Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%C=Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%T=凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠濃度越大，孔徑越小。凝膠濃度過(guò)大，膠硬而脆，易折斷。濃度過(guò)小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。當(dāng)凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為5%時(shí)，凝膠具有最小孔徑，超過(guò)5%或低于5%時(shí)凝膠孔徑都要增大。當(dāng)前120頁(yè)，總共141頁(yè)。在濃度為7.5%

的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。因此，把濃度為7.5%

凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。對(duì)于一個(gè)未知樣品，常用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)膠或4%-10%

的凝膠梯度來(lái)測(cè)試，而后選出適宜的凝膠濃度。用于研究大分子核酸的凝膠多為2.4%的大孔凝膠，此時(shí)凝膠太軟，不易操作，可加入0.5%瓊脂糖，或在3%凝膠中加入20%蔗糖以增加機(jī)械強(qiáng)度而又不影響凝膠孔徑大小。當(dāng)前121頁(yè)，總共141頁(yè)。3.不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

1）凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠（2~3％），下層為小孔徑的分離膠（5~15％）。

2）緩沖液離子組成的不連續(xù)性。主要是陰離子不同（Gly-,Cl-）。

3）凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.8的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

4）在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度。在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。當(dāng)前122頁(yè)，總共141頁(yè)。Tris-GlypH=8.3Tris-GlypH=8.3Tris-HClpH=6.8T=3%Tris-HClpH=8.9T=7.5%當(dāng)前123頁(yè)，總共141頁(yè)。當(dāng)前124頁(yè)，總共141頁(yè)。4.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測(cè)蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)各組分的電泳遷移率的不同。這種差異就蛋白質(zhì)分子本身而言，主要與其所帶凈電荷以及分子量和形狀有關(guān)。當(dāng)電泳體系中含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS）時(shí)，則得電泳遷移率的大小只取決于蛋白質(zhì)的分子量，從而可直接由電泳遷移率推算出蛋白質(zhì)的分子量。

當(dāng)前125頁(yè)，總共141頁(yè)。SDS的作用原理

這種陰離子去污劑能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)分子部、分子之間以及與其它物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵,使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械目臻g構(gòu)象。

當(dāng)SDS的總量為蛋白量的3～10倍且SDS單位濃度大于1mol./L時(shí)，這兩者的結(jié)合是定量的，大約每克蛋白質(zhì)可結(jié)合1.4克SDS。

蛋白質(zhì)分子一經(jīng)結(jié)合了一定量的SDS陰離子，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了它原有電荷量，從而消除了不同種類蛋白質(zhì)間電荷符號(hào)的差異。且由于分子量越大的蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS越多，所帶負(fù)電荷也越多，這就使各蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的電荷密度趨于一致。當(dāng)前126頁(yè)，總共141頁(yè)。不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物形狀也相似，均是長(zhǎng)橢球狀。

在電泳過(guò)程中，遷移率僅取決于蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的大小，也可以說(shuō)是取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，而與蛋白質(zhì)原來(lái)所帶電荷量無(wú)關(guān)。

m=V/E=Q/6πrη

令：Q/η=C

則：m=V/E=C/6πr在SDS-電泳中，蛋白質(zhì)的泳動(dòng)度與其大小成反比當(dāng)前127頁(yè)，總共141頁(yè)。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在17,000～165,000之間時(shí)，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系：lgMW=lgK－bm

MW為蛋白質(zhì)的分子量，m為相對(duì)遷移率，K為常數(shù)，b為斜率

將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要測(cè)得未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下的電泳遷移率，就能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量。當(dāng)前128頁(yè)，總共141頁(yè)。當(dāng)前129頁(yè)，總共141頁(yè)。5.聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳(IsoelectricFocusing，IEF)聚丙烯酰胺凝膠中加入一種合成的兩性電解質(zhì)載體，在電場(chǎng)的作用下會(huì)自發(fā)形成一個(gè)連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)樣品在電泳中被分離，運(yùn)動(dòng)