氨基酸紙層析

0000實(shí)驗(yàn)教學(xué)教案首頁(yè)本次實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：氨基酸紙層析本次實(shí)驗(yàn)課時(shí)：4學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)類型：驗(yàn)證性教學(xué)要求：通過(guò)氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法掌握氨基酸紙上層析法的操作技術(shù)（點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、鑒定）原理,能夠?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果做出正確判斷重點(diǎn)：：氨基酸紙上層析法的操作技術(shù)難點(diǎn)：紙層析法的基本原理教學(xué)手段及教具：課堂講授，學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作。講授內(nèi)容及時(shí)間分配：課堂講授課堂講授實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.2學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)原理0.3學(xué)時(shí)3?儀器、材料和試劑0.2學(xué)時(shí)4.操作步驟及注意事項(xiàng)0.3學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)氨基酸紙層析的操作4學(xué)時(shí)參考資料《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》指導(dǎo)書(shū)參考資料《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》指導(dǎo)書(shū)氨基酸紙層析法驗(yàn)證性）氨基酸紙層析法驗(yàn)證性）相關(guān)知識(shí)層析法（色譜法）：是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的（稱為固定相），另一個(gè)相則流此固定相（稱為流動(dòng)相）并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)分離。2．幾種常用的層析法①吸附層析②離子交換層析③薄層層析④凝膠層析（凝膠過(guò)濾）⑤親和層析⑥分配層析（適于在水，有機(jī)溶劑中都可溶的混合物）當(dāng)把一種物質(zhì)在兩種不混溶的溶劑中振蕩時(shí)，它將在這兩相中不均勻的分配。達(dá)到平衡時(shí)，這種物質(zhì)在兩種溶劑中的濃度之比是一個(gè)常數(shù)，即分配系數(shù)。物質(zhì)在溶劑I中的濃度a=

物質(zhì)在溶劑II中的濃度如果某一混全物的各組分在這兩相中的分配系數(shù)有足夠的差異，它們就可以被分離。3．氨基酸的極性大小及各氨基酸結(jié)構(gòu)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法掌握氨基酸紙上層析法的操作技術(shù)（點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、鑒定）二、實(shí)驗(yàn)原理紙層析法是分配層析的一種，以濾紙作為惰性支持物。層析溶劑（擴(kuò)展劑）由有機(jī)溶劑和水組成。在紙上水被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相。由于纖維素上的羥基具有親水性，和水以氫鍵相連，使這部分水不易擴(kuò)散，所以能與跟水混合的溶劑仍然形成類似不相混合的兩相。當(dāng)有機(jī)相沿紙流動(dòng)經(jīng)過(guò)層析點(diǎn)時(shí)，層析點(diǎn)上溶質(zhì)就在水相和有機(jī)相之間進(jìn)行分配，有一部分溶質(zhì)離開(kāi)原點(diǎn)隨有機(jī)相移動(dòng)而進(jìn)入無(wú)溶質(zhì)的區(qū)域，這時(shí)又重新進(jìn)行分配，一部分溶質(zhì)從有機(jī)相進(jìn)入水相。當(dāng)有機(jī)相不斷流動(dòng)時(shí)，溶質(zhì)就沿著有機(jī)相流動(dòng)的方向移動(dòng)，不斷進(jìn)行分配。溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，移動(dòng)速率也不同，因而可以彼此分開(kāi)。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值（比移）來(lái)表示的。RfRf=原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到溶劑前沿的距離在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、PH層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。氨基酸、糖、核甘酸、甾體激素、維生素、抗生素等很多物質(zhì)都能用紙上層析法分離。上層層析、下層層析、單向?qū)游?、雙向?qū)游?。三、儀器、材料和試劑儀器：每組學(xué)生準(zhǔn)備尺子、小剪子或小刀1．層析缸、培養(yǎng)皿、量筒、小燒杯、長(zhǎng)頸漏斗、毛細(xì)管、吹風(fēng)機(jī)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、層析濾紙、手套、透明膠帶。實(shí)驗(yàn)材料和試劑1．標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液分別配制0.5%的Lys、Ala、Ile、Met溶液2．待分離測(cè)定的混合氨基酸溶液顯色劑0.1%水合茚三酮丙酮溶液。4.擴(kuò)展劑（展層劑）：本實(shí)驗(yàn)使用酸溶劑系統(tǒng)酸溶劑系統(tǒng)：正丁醇：80%甲酸:水=15:3:2（體積比），平衡溶劑與擴(kuò)展劑相同。四、操作步驟層析缸：三個(gè)組共用一個(gè)。層析缸中放入三個(gè)培養(yǎng)皿（注意墊平）配制酸溶液系統(tǒng)：每組用量筒用配制30ml入小燒杯，再放入層析缸中，作為平衡溶劑，密閉。問(wèn)題：平衡溶劑的作用是？戴手套取層析濾紙一張。在紙的一端（縱紋）距邊緣1.5~2cm處用鉛筆劃一條直線，而后進(jìn)行分隔（5個(gè)點(diǎn)）。問(wèn)題：為什么戴手套取層析濾紙？練習(xí)點(diǎn)樣：用毛細(xì)管吸水在濾紙條上練習(xí)。達(dá)到均勻透過(guò)濾紙，大小不超過(guò)3mm的點(diǎn)樣跡。正式點(diǎn)樣：用毛細(xì)管將各氨基酸樣品分別點(diǎn)在這5個(gè)位置上，干后再點(diǎn)一次。注意：兩次點(diǎn)樣一定不要將不同的樣品點(diǎn)在一個(gè)點(diǎn)上。小組成員認(rèn)真仔細(xì)合作。不要用手觸摸到濾紙。點(diǎn)樣面朝外，紙的兩邊不能接觸。用膠帶小條（1~2mm寬）將濾紙粘成筒狀。將筒狀濾紙直立于培養(yǎng)皿中（點(diǎn)樣的一端在下），蓋上層析缸蓋，平衡約.10分鐘。將長(zhǎng)頸漏斗置于筒狀濾紙中并與培養(yǎng)皿底部接觸，將約25mL左右擴(kuò)展劑（即平衡溶劑）沿長(zhǎng)頸漏斗傾于培養(yǎng)皿，擴(kuò)展劑的液面需低于點(diǎn)樣線1cm。密閉。問(wèn)題：為什么加入的展層劑的液面需低于點(diǎn)樣線？展層：當(dāng)溶劑展層至距離紙的上沿約1厘米時(shí)，取出濾紙，立即用鉛筆標(biāo)出溶劑前沿界線，自然干燥或用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干。顯色：將已層析的濾紙用攝子夾住邊，在0.1%茚三酮丙酮溶液中雙而均勻浸透后拿出，然后置烘箱（65°C）烘烤5分鐘。問(wèn)題：除哪幾種氨基酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)？其它a—氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮產(chǎn)生蘭紫色物質(zhì)。其原理是？五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析討論計(jì)算各種氨基酸的Rf并排出遷移率順序。確定混合液中氨基酸