腫瘤基因突變檢測

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癌癥是一類難以預防的疾病，中晚期癌癥治愈的也許性又非常小，而早期癌癥的治愈率可達65%以上，有點腫瘤可達90%以上，所以，戰(zhàn)勝癌癥的關鍵是早期發(fā)覺癌癥。由于癌癥早期常無特別癥狀，甚至毫無癥狀，故癌癥的早期發(fā)覺、早期診斷要緊是經(jīng)過定期健康體檢和人群篩查完成。目前篩查癌癥的辦法要緊是經(jīng)過化驗血腫瘤指標及B超、CT、MRI、PET-CT等檢查，但這些辦法的敏感性和特異性均別高，發(fā)覺有異常時往往已是中晚期。

17種常見高發(fā)腫瘤，包括乳腺癌（breastcancer）、結腸癌（colorectalcancer）、子宮癌（endometrialcancer）、腦膠質(zhì)瘤（glioma）、白血?。╨eukemia）、肺癌（lunXXXancer）、淋巴癌（lymphoma）、成神經(jīng)管細胞瘤（medulloblastoma）、黑群素癌(melanoma)、間皮瘤(mesothelioma)、多性骨髓瘤(multiplemyeloma)、卵巢癌(ovariancancer)、胰腺癌(pancreaticcancer)、真性紅細胞增多(polycythemiavera)、前列腺癌(prostatecancer)、腎細胞癌(renalcellcancer)和惡性內(nèi)瘤(sarcoma)，其發(fā)病機制涉及與多種腫瘤發(fā)生共同相關的腫瘤易感基因群介導的分子改變，參與了腫瘤發(fā)生的早期分子事件。系統(tǒng)尋覓和探討它們在腫瘤發(fā)生進展過程中的遺傳學變異，對闡明腫瘤早期發(fā)生機制及尋覓腫瘤早期預警、早期診斷和早期治療的分子靶標都具有重要的現(xiàn)實意義。利用高通量分子測序技術平臺，可并且開展多個腫瘤基因突變檢測項目，如EGFR、K-RAS、N-RAS、B-RAF、PI3K、p53、p16、BRCA1、

BRCA2等。

K-RAS基因(K-ras,p21)突變檢測

KRAS基因（K-ras,p21）檢測是目前大夫了解大腸癌患者癌基因狀況最直截了當、最有效的辦法，經(jīng)過檢測別僅能夠深入了解癌基因的事情，更重要的是篩選出針對抗表皮生長因子受體靶向藥物治療有效的大腸癌患者，幫助大夫挑選對腫瘤病人最有效的治療辦法。

RAS基因家族與人類腫瘤相關的基因有三種——HRAS、KRAS和NRAS，分不定位在11、12和1號染群體上。在RAS基因中，KRAS對人類癌癥妨礙最大，正常時，它能操縱調(diào)控細胞生長的路徑；發(fā)生異常時，則導致細胞持續(xù)生長，并阻撓細胞自我毀滅，別能產(chǎn)生正常RAS蛋白，使細胞內(nèi)信號傳導紊亂，細胞增殖失控而癌變。

原癌基因（K-ras）突變發(fā)生于多種癌癥，例如結腸癌、肺癌、甲狀腺癌、胰腺癌、膽

K-RAS的異常激活有關，參與EGFR信號傳導通路。結直腸癌患者中K-RAS基因的突變率約為35-40%,而且90%的突變發(fā)生在12、13位密碼子，可導致p21-ras蛋白的生長信號的異常變化。該基因是TKI治療的靶分子，攜帶有K-RAS基因突變的患者對TKI治療別敏感。過度的生長信號可刺激細胞生長和增殖從而導致了癌癥的發(fā)生。

K-ras基因檢測（K-ras,p21）臨床意義:檢測K-ras基因突變是深入了解癌基因的事情，了解各種癌癥的進展預后，放化療療效的重要指標。⑴K-ras基因突變發(fā)生在腫瘤惡變的早

期，同時原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的K-ras基因高度保持一致，普通以為，K-ras基因狀態(tài)不可能因治療而發(fā)生變化。⑵K-ras基因突變見于20%的非小細胞肺癌(NSCLC)，其中肺腺癌占30%～50%。大腸癌患者K-ras突變率為30%～35%。

【檢測位點】

ID突變外顯子堿基變化Cosmic

Gly12Asp12GGT＞GAT521

Gly12Val12GGT＞GTT520

Gly12Ser12GGT＞AGT517

Gly12Cys12GGT＞TGT516

Gly12Ala12GGT＞GCT522

Gly12Arg12GGT＞CGT518

Gly13Asp13GGC＞GAC532

BRAFV600E基因突變檢測

BRAF是一種癌基因，它編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的轉(zhuǎn)導因子，參與調(diào)控細胞內(nèi)多種生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡等。研究表明，在多種人類惡性腫瘤中，如惡性黑群素瘤、結直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在別同比例的BRAF基因突變，約66%惡性黑XXX素瘤和15％的結腸癌中BRAF基因存在體細胞錯義突變。大約80-90%的BRAF基因突變發(fā)生在exon15的1799核苷酸上，T突變?yōu)锳，導致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E)。目前以為，V600E突變可模擬T599和S602兩個位點的磷酸化過程，從而使BRAF蛋白異常激活。BRAF突變狀態(tài)與多種腫瘤的發(fā)生、進展及臨床結局有關。隨著BRAF突變研究的深入，可望為闡明腫瘤發(fā)生的分子機制，尋覓新的治療途徑與靶點提供思路。

BRAF基因突變作為乳頭狀甲狀腺癌（PTC）發(fā)生的驅(qū)動性突變，差不多成為PTC細針穿刺細胞學標本診斷和病情預后的一具重要指標。BRAF基因突變率在PTC中高達44%，具有非常好的診斷意義。BRAF基因突變陽性的甲狀腺癌病人較突變陰性病人預后別良。在黑XXX素瘤的治療方面，針對BRAF基因突變所研發(fā)的新型靶向藥物威羅菲尼（Vemurafenib）對BRAF基因V600E突變的患者療效顯著。在結直腸癌中，BRAF基因突變的患者對EGFR靶向藥物也許存在原發(fā)耐藥，所以，美國國家癌癥綜合治療聯(lián)盟（NCCN）《結直腸癌臨床實踐指南》（2013）建議，在使用愛必妥（Cetuximab）或帕尼單抗（Panitumumab）等靶向藥物時，對KRAS基因野生型患者進一步檢測BRAF基因狀態(tài)。

威羅菲尼（Zelboraf,vemuragenib,PLX4032）獲準用于治療別可手術且經(jīng)FDA批準的BRAFV600E突變檢測呈陽性的轉(zhuǎn)移性黑XXX素瘤患者。在批準該藥的并且，F(xiàn)DA還并且批準了用于黑群素瘤患者相應突變檢測的BRAFV600E突變檢測。臨床研究發(fā)覺，EGFR信號通路中的BRAF基因V600E突變的病人對EGFR單抗原發(fā)耐藥。所以，推舉腫瘤患者同意EGFR靶向藥物治療前，舉行BRAF基因V600E突變的檢測。而且，2011年版《NCCN結直腸癌臨床實踐指南》中明確指出結直腸癌患者應舉行BRAF基因V600E突變的檢測，假如患者存在V600E突變時，一線治療發(fā)展后使用抗EGFR單抗治療是無效的。BRAF基因突變檢測能提高臨床治療的針對性，指導靶向藥物的合理使用，幸免無效或治療別當造成的病人病情延誤，落低治療風險。

有研究證明，在野生型KRAS腫瘤當中，發(fā)生BRAFV600E突變的個體，對Panitumumab/帕尼單抗和Cetuximab/西妥昔單抗徹底別反應，而沒發(fā)生BRAF突變的野生型個體，32%有反應，68%沒反應。這提示今后重點檢測BRAF的突變可為今后結腸癌臨床用藥賦予指導，BRAF基因突

變的患者同意EGFR-TKI藥物治療的有效率低。而且，BRAFV600E突變可導致部分KRAS基因野生型患者對EGFR-TKI及EGFR單抗藥物治療別敏感。所以檢測腫瘤患者B-RAF基因突變事情可用于指導EGFR-TKI的靶向用藥。

檢測位點：V600E。

B-raf基因突變檢測實例

A．BRAF第600密碼子野生型測序圖譜

B．BRAF第600密碼子突變型測序圖譜

EGFR基因突變檢測

肺癌是當今世界各國常見的惡性腫瘤，并已成為絕大多數(shù)國家癌癥死亡的要緊緣故。其中以非小細胞肺癌(NSCLC)最常見。目前靶向治療差不多成為NSCLC臨床治療的重要手段。易瑞沙（Iressa/吉非替尼/Gefitinib,阿斯利康）和特羅凱（Tarceva/厄羅替尼/Erlotinib，羅氏制藥）作為表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，是美國FDA批準用于NSCLC

靶向治療的要緊藥物。易瑞莎和特羅凱是近年來開辟的兩種特異性較高的治療NSCLC的腫瘤靶向治療藥物，該類藥物經(jīng)過抑制腫瘤發(fā)生、進展中必須的表皮生長因子受體酪氨酸激酶活性，從而達到抑制腫瘤細胞的增生、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成并促進腫瘤細胞的調(diào)亡。然而，臨床試驗表明易瑞沙和特羅凱僅對10-30%的NSCLC病人有顯著療效。進一步的研究發(fā)覺EGFR基因突變與NSCLC靶向治療的療效具有相關性，絕大多數(shù)攜帶EGFR基因突變的病人療效顯著。

EGFR基因29種突變：

EGFR第18外顯子片段長度為437bp，核苷酸2155G＞A突變（G719S）；

EGFR第19外顯子片斷長度為411bp，要緊突變有：

核苷酸2235-2249Del（E746－A750del）

核苷酸2236-2250Del（E746－A750del）

核苷酸2254-2277Del（S752－I759del）

其它核苷酸片段缺失、插入、重復現(xiàn)象，如L747-T75linsA，L747-P753insS（747位亮氨酸至第753位苯丙氨酸缺失，插入絲氨酸）和L747-A750del。

EGFR第21外顯子，片段長度為399bp，要緊突變有：

核苷酸2576T－G（L858R）

核苷酸2497T－G（L833V）

核苷酸2504A－T（H835L）

核苷酸2556位插入堿基G（q852）

采納臨床突變檢測公認的“金標準”——Sanger測序法舉行檢測：

1、個體化指導：選出對患者效果最佳的藥物，為大夫提供個體化用藥的科學依據(jù)；

2、指導EGFR-TKI類藥物的合理使用，幫助大夫為患者挑選最優(yōu)的治療方案；

3、幸免別合適藥物無效治療造成的病情延誤，落低治療風險，節(jié)約醫(yī)療資源。

【檢測位點】

ID突變外顯子堿基變化Cosmic

G719A182156G>C6239

2155G>A6252

G719S18

G719C182155G>T6253

E746-A750del(1)192235-2249del156223

E746-A750del(2)192236-2250del156225

L747-P753>S192240-2257del1812370

13551

E746-A750>I192235-2252>AAT(complex)

E746-A750del192235-2253del1812728

del1512678

E746-A750>A192237-2251

del1812367

E746-S752>A192237-2254

>T(complex)12384

E746-S752>V192237-2250

del186220

E746-S752>D192238-2255

12422

>GC(complex)

L747-A750>P192238-2248

>GCA(complex)

12419

L747-T751>Q192238-2252

L747-E749del192239-2247del96218

L747-T751del192239-2253del156254

L747-S752del192239-2256del186255

L747-A750>P192239-2248TTAAGAGAAG

>C12382

L747-P753>Q192239-2258>CA(complex)12387

L747-T751>S192240-2251del126210

L747-T751del192240-2254del1512369

>C(complex)12383

L747-T751>P192239-2