蛋白質(zhì)定量：(BCA法)

BCA(bicinchoninicacid)就是一種穩(wěn)定得水溶性復合物,在堿性條件下,二價銅離子可以被蛋白質(zhì)還原成一價銅離子,一價銅離子可以與BCA相互作用,兩分子得BCA螯合一個銅離子,形成紫色得絡(luò)合物,該復合物為水溶性,在562nm處顯示強吸光性,在一定濃度范圍內(nèi),吸光度與蛋白質(zhì)含量呈良好得線性關(guān)系,制作標準曲線,因此可以根據(jù)待測蛋白在562nm處得吸光度計算待測蛋白濃度。備1。BCA定量試劑盒:含A液與B液A液:BCA堿性溶液(配方:1%BCA二鈉鹽,0。4%氫氧化鈉,0、16%酒石酸鈉,2％無水碳酸鈉,0、95%碳酸氫鈉,這些液體混合后再調(diào)PH至11。25)B2.牛蛋白血清(BSA)1.配置BCA工作液:將A液與B液搖晃混勻,按照A:B＝50:1得比例配置BCA分混勻。(BCA工作液室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定,故現(xiàn)用現(xiàn)配)2、配置不同濃度得標準蛋白液(BSA),1ug/ul,2、5ug/ul,5ug/ul,7.5ug/ul,10ug/ul,待測蛋白樣品在什么溶液中,就用該溶液來稀釋標準蛋白液(如待測樣品溶于強RIPA裂解液,則用強RIPA裂解液來稀釋標準蛋白液)。3.取空白組(0ug/ulBSA)各濃度得標準蛋白液5ul加入96孔板中,另取待測得PS:上圖加樣得量僅作為參考,蛋白液與BCA工作液得比例符合即可、PSBCA法測定蛋白濃度時,吸光度可隨時間得延長不斷加深,且顯色反應(yīng)會隨溫度升高而加快,故如果濃度較低,適合較高溫度孵育or延長孵育時間。標準蛋白液得加量應(yīng)當準確,如果加量不準確,會導致制作出來得標準曲線出現(xiàn)偏影響待測樣品得濃度計算,所以一方面需要用梯度稀釋得方法來配置標準蛋白當結(jié)果出現(xiàn)空白組本身就有較高得背景,可用Bradford法重新測定蛋白濃度。干擾物質(zhì)少,BCA法不受大部分樣品中得去垢劑等化學物質(zhì)影響,可兼容樣品中圍內(nèi),有良好得線性關(guān)系檢測不同蛋白質(zhì)分子得變異系數(shù)小于考馬斯亮藍法蛋白定量與熒光蛋白質(zhì)定量等方法相比,屬于化學呈色法得BCA法檢測靈敏度尚不夠蔗糖、尿素、NH4+與EDTA影響測定結(jié)果BCA蛋白定量與Bradford法蛋白定量得區(qū)別:1、Bradford法測得得主要就是堿性氨基酸與芳香族氨基酸,BCA則沒有選擇性?2、BCA法蛋白濃度定量就是二價銅離子在堿性得條件下,可以被蛋白質(zhì)還原成一價銅離子(biuretreaction),一價銅離子與獨特得BCASolutionA(含有BCA)相互作用產(chǎn)生敏感得顏色反應(yīng)、兩分子得BCA螯合一個銅離子,形成紫色得反應(yīng)復合物。該水溶性得復合物在562nm處顯示強烈得吸光性,吸光度與蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好得白質(zhì)結(jié)合后引起染料最大吸收得改變,從465nm變?yōu)?95nm,光吸收增加。蛋白質(zhì)染料復合物具有高得消光系數(shù),因此大大提高了蛋白質(zhì)測定得靈敏度,最低檢出量為1μg蛋白。染料與蛋白質(zhì)得結(jié)合就是很迅速得過程,大約需2min,結(jié)合物得顏色在1h內(nèi)就是穩(wěn)定得。一些陽離子,如K＋,Na+,Mg2＋