基于納米材料新型電化學(xué)傳感器的制備及其在生物樣品分析中的應(yīng)用研究報(bào)告

-.z基于納米材料新型電化學(xué)傳感器的制備及其在生物樣品分析中的應(yīng)用研究【摘要】：電化學(xué)生物傳感器結(jié)合了信息技術(shù)與生物技術(shù),涉及化學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)以及電子學(xué)等學(xué)科。由于其具有體積小、分辨率高、響應(yīng)時(shí)間短、所需樣品少、對(duì)活細(xì)胞損傷小等特點(diǎn),電化學(xué)生物傳感器在醫(yī)藥工業(yè)、食品檢測和環(huán)境保護(hù)等諸多領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。近年來,隨著材料科學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)等學(xué)科的開展,納米材料因具有特殊的構(gòu)造效應(yīng),如小尺寸效應(yīng)、外表界面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)及介電限域效應(yīng)等,使其在許多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。目前,采用納米材料構(gòu)建新型的電化學(xué)生物傳感器日益成為研究熱點(diǎn)。納米材料應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器領(lǐng)域后,不僅提高了傳感器的檢測性能,而且使傳感器的化學(xué)和物理性質(zhì)以及它對(duì)生物分子或者細(xì)胞的檢測靈敏度大幅提高,檢測時(shí)間也得以縮短,并且可實(shí)現(xiàn)高通量的實(shí)時(shí)分析檢測。本論文的工作主要集中在將納米技術(shù)和電化學(xué)傳感技術(shù)相結(jié)合,開發(fā)了基于納米材料的新型電化學(xué)生物傳感器并將其用于檢測水體中大腸桿菌和細(xì)胞外表的多聚糖。該傳感技術(shù)為水體中大腸桿菌的快速檢測提供了新方法,同時(shí)也為腫瘤疾病的早期診斷及治療提供了新途徑。具體研究內(nèi)容如下：第一局部：CuAu復(fù)合納米粒子標(biāo)記抗體的電化學(xué)免疫方法用于水體中大腸桿菌的快速檢測本文制備了CuAu復(fù)合納米粒子,并將其用于標(biāo)記大腸桿菌抗體,利用電化學(xué)免疫技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)水體中大腸桿菌的快速檢測。CuAu復(fù)合納米粒子具有優(yōu)良的生物相容性、電化學(xué)活性和穩(wěn)定性。與單獨(dú)的金納米顆粒相比,CuAu復(fù)合納米粒子作為抗體標(biāo)記物大幅提高了電化學(xué)檢測的靈敏度。在實(shí)驗(yàn)過程中,首先將大腸桿菌吸附在聚苯乙烯修飾的ITO導(dǎo)電玻璃外表,利用抗體和大腸桿菌之間的免疫反響把CuAu復(fù)合納米粒子標(biāo)記的抗體結(jié)合在ITO導(dǎo)電玻璃外表。將CuAu復(fù)合納米粒子在溴氫酸中氧化為離子形式,然后用陽極溶出伏安法定量檢測溶液中的Cu2+。為了提高檢測靈敏度,采用Nafion/汞膜修飾的玻碳電極(GCE/Nafion/Hg)作為工作電極,Cu2+的檢測限可達(dá)9.0×10-12M。結(jié)果說明,在50cfu/mL～5.0×104cfu/mL濃度*圍內(nèi),銅的響應(yīng)電流與大腸桿菌濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系,檢測限為30cfu/mL,總的分析時(shí)間為2h。將研究的電化學(xué)免疫方法用于地表水中大腸桿菌的測定,通過對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)展預(yù)富集,能夠檢測到大腸桿菌的濃度為3cfu/10mL。第二局部：基于磁性高分子微球的電化學(xué)DNA生物傳感器用于水體中大腸桿菌的檢測本文研制了一種新型的基于磁性高分子微球的電化學(xué)DNA生物傳感器,并將其用于水體中大腸桿菌的檢測。以海藻酸包裹鈷的磁性高分子微球作為DNA探針的固體基質(zhì),根據(jù)大腸桿菌細(xì)胞體內(nèi)uidA基因合成了特異性的DNA序列,制備了用于大腸桿菌檢測的DNA探針。利用透射電鏡技術(shù)對(duì)制備的磁性高分子微球進(jìn)展了表征,并通過紅外光譜法證實(shí)了特定DNA序列與磁性高分子微球的成功連接。在DNA雜交前后,分別對(duì)嵌入式雜交指示劑柔紅霉素進(jìn)展電化學(xué)測定,根據(jù)電化學(xué)信號(hào)的變化對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)展檢測。采用非互補(bǔ)DNA序列、三個(gè)堿基錯(cuò)配的DNA序列及完全互補(bǔ)DNA序列驗(yàn)證了DNA探針的選擇性。實(shí)驗(yàn)過程中利用聚合酶鏈反響(PCR)技術(shù)提取了大腸桿菌細(xì)胞體內(nèi)uidA基因片斷,并用電化學(xué)DNA生物傳感器對(duì)經(jīng)過熱處理后的PCR產(chǎn)物和水體中大腸桿菌進(jìn)展了測定。結(jié)果說明,本文研制的電化學(xué)DNA生物傳感器可以檢測到0.30nM完全互補(bǔ)DNA序列和0.50ng/μL的PCR產(chǎn)物,對(duì)大腸桿菌的檢出限為50cfu/mL。第三局部：基于二茂鐵修飾氧化鋅納米棒的信號(hào)放大策略用于水體中大腸桿菌的電化學(xué)免疫檢測本文將大腸桿菌檢測抗體(dAb)和二茂鐵(Fc)共同修飾于氧化鋅納米棒(ZnONRs)外表制備了{(lán)dAb-ZnO-Fc}生物復(fù)合物,并將其用于水體中大腸桿菌的電化學(xué)免疫檢測。采用BCA蛋白測定法(BCAproteinassay)和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)分別對(duì)檢測抗體和二茂鐵在氧化鋅納米棒上的最優(yōu)配比進(jìn)展了研究。該生物復(fù)合物利用二茂鐵作為電活性物質(zhì)產(chǎn)生電信號(hào),檢測抗體用于免疫結(jié)合大腸桿菌。采用“**治〞夾心構(gòu)造,首先將捕獲抗體固定在巰基乙酸修飾的金電極外表,然后通過免疫反響結(jié)合大腸桿菌,進(jìn)而吸附{dAb-ZnO-Fc}生物復(fù)合物,最后用示差脈沖伏安法測定固定在電極外表上的二茂鐵。通過分析檢測不同濃度大腸桿菌溶液獲得的電流信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的定量檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,在1.0×102cfu/ML～1.0×106cfu/mL濃度*圍內(nèi),二茂鐵的電流信號(hào)與大腸桿菌濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系,檢出限為50cfu/mL。通過對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)展富集濃縮,該電化學(xué)免疫技術(shù)可以檢測到5cfu/10mL大腸桿菌。第四局部：巰基糖衍生物功能化的電化學(xué)生物傳感器用于活體腫瘤細(xì)胞外表多聚糖的競爭檢測本文合成了巰基糖衍生物用于構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器,采用競爭策略檢測活體腫瘤細(xì)胞外表多聚糖的表達(dá)水平。該傳感器利用納米金/碳納米管修飾玻碳電極(GCE/MWNT/AuNP)為基底,通過Au-S鍵固定巰基糖衍生物。此外,采用碳納米管為載體固定辣根過氧化酶(HRP)和刀豆球蛋白(ConA)制備了{(lán)ConA-MWNT-HRP}生物復(fù)合物。以人體肺、肝、前列腺組織中活體腫瘤細(xì)胞外表甘露糖為研究對(duì)象,利用甘露糖和刀豆球蛋白的特異性結(jié)合,傳感器外表的巰基糖衍生物與細(xì)胞外表的甘露糖競爭結(jié)合{ConA-MWNT-HRP}生物復(fù)合物。以對(duì)苯二酚為電子媒介體,通過測定辣根過氧化酶催化過氧化氫產(chǎn)生的響應(yīng)電流對(duì)活細(xì)胞外表的多聚糖進(jìn)展檢測。結(jié)果說明,在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,本方法用于腫瘤細(xì)胞的定量檢測具有寬的線性*圍和低的檢測限。同時(shí),我們計(jì)算了每個(gè)細(xì)胞外表甘露糖的數(shù)目：每個(gè)肺癌細(xì)胞A549含有甘露糖的數(shù)目為5.8×1010個(gè),每個(gè)肝癌細(xì)胞QGY-7703含有甘露糖的數(shù)目為1.3×1010個(gè),每個(gè)前列腺癌細(xì)胞LNCaP含有甘露糖的數(shù)目為1.9×1010個(gè)。本文所研制的巰基糖衍生物功能化的電化學(xué)生物傳感器用于甘露糖的測定具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)信號(hào)快等優(yōu)點(diǎn),為活細(xì)胞外表多聚糖的檢測提供了新的方法。第五局部：凝集素電化學(xué)生物傳感器用于活體腫瘤細(xì)胞外表多聚糖的檢測研究本文制備了一種高靈敏度和高選擇性的凝集素(lectins)生物傳感器并將其用于檢測甘露糖(mannose)和唾液酸(sialicacid)在人體肺、肝、前列腺組織中正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞外表的表達(dá)水平。采用碳納米管/納米金(MWNT/AuNP)修飾電極固定凝集素,利用細(xì)胞外表的多聚糖(glycans)和凝集素之間的特異性相互作用將細(xì)胞吸附在傳感器外表,然后結(jié)合硫堇(Th)包被金納米粒子標(biāo)記的凝集素{lectin-Au-Th}構(gòu)建“**治〞夾心構(gòu)造。最后用示差脈沖伏安法(DPV)定量檢測硫堇,實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞外表多聚糖的測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,甘露糖在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞外表的表達(dá)水平普遍較高；唾液酸在腫瘤細(xì)胞外表的表達(dá)水平要明顯高于其在正常細(xì)胞外表的表達(dá),研究結(jié)果對(duì)于提醒腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為具有一定的指導(dǎo)意義。同時(shí),依據(jù)腫瘤細(xì)胞外表唾液酸與接骨木凝集素(SNA)的特異性相互作用,將該電化學(xué)生物傳感器定量檢測了人體肺、肝、前列腺組織中的腫瘤細(xì)胞和每個(gè)腫瘤細(xì)胞外表唾液酸的含量并獲得了滿意的結(jié)果。本方法具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點(diǎn),在腫瘤疾病的早期診斷中具有很好的應(yīng)用前景。【關(guān)鍵詞】：電化學(xué)生物傳感器納米材料大腸桿菌多聚糖

【學(xué)位授予單位】：華東師*大學(xué)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【學(xué)位授予年份】：2011

【】：TP212.2

【目錄】：論文摘要6-10ABSTRACT10-18第一章緒論18-47第一節(jié)電化學(xué)生物傳感器19-26第二節(jié)納米材料及其在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用26-34第三節(jié)大腸桿菌和細(xì)胞外表多聚糖的檢測意義34-36第四節(jié)本論文的主要研究內(nèi)容36-38參考文獻(xiàn)38-47第二章CuAu復(fù)合納米粒子標(biāo)記抗體的電化學(xué)免疫方法用于水體中大腸桿菌的快速檢測47-581.引言47-482.實(shí)驗(yàn)局部48-502.1試劑與儀器48-492.2平板計(jì)數(shù)法492.3CuAu復(fù)合納米粒子的制備及大腸桿菌抗體的標(biāo)記49-502.4免疫檢測過程503.結(jié)果與討論50-553.1CuAu復(fù)合納米粒子的表征50-513.2電化學(xué)免疫方法的檢測機(jī)理51-523.3免疫反響條件的優(yōu)化52-533.4CuAu復(fù)合納米粒子的氧化和Cu~(2+)的電化學(xué)檢測條件優(yōu)化533.5電化學(xué)免疫技術(shù)檢測大腸桿菌53-543.6其它細(xì)菌的干擾實(shí)驗(yàn)54-553.7地表水中大腸桿菌的檢測554.結(jié)論55參考文獻(xiàn)55-58第三章基于磁性高分子微球的電化學(xué)DNA生物傳感器用于水體中大腸桿菌的檢測58-691.引言58-602.實(shí)驗(yàn)局部60-622.1試劑與儀器60-612.2磁性高分子微球的制備612.3DNA探針的制備612.4大腸桿菌特異性u(píng)idA基因片斷提取61-622.5大腸桿菌的電化學(xué)檢測623.結(jié)果與討論62-663.1磁性高分子微球及DNA探針的表征62-633.2DNA電化學(xué)檢測機(jī)理63-643.3DNA雜交條件的優(yōu)化64-653.4DNA探針的選擇性研究65-663.5DNA探針用于特定DNA序列的電化學(xué)定量檢測664.結(jié)論66-67參考文獻(xiàn)67-69第四章基于二茂鐵修飾氧化鋅納米棒的信號(hào)放大策略用于水體中大腸桿菌的電化學(xué)免疫檢測69-841.引言69-702.實(shí)驗(yàn)局部70-722.1試劑與儀器70-712.2大腸桿菌的培養(yǎng)與平板計(jì)數(shù)法712.3{_dAb-ZnO-Fc}生物復(fù)合物的制備71-722.4免疫傳感器的制備722.5大腸桿菌的檢測723.結(jié)果與討論72-813.1氧化鋅納米棒修飾氨基前后的表征72-733.2電化學(xué)免疫方法的檢測原理73-743.3免疫傳感器的電化學(xué)表征74-753.4{_dAb-ZnO-Fc}生物復(fù)合物中檢測抗體和二茂鐵含量的研究75-783.5免疫反響條件的優(yōu)化783.6基于{_dAb-ZnO-Fc}生物復(fù)合物的電化學(xué)放大免疫分析78-803.7電化學(xué)免疫技術(shù)的重現(xiàn)性、特異性和穩(wěn)定性研究803.8實(shí)際樣品中大腸桿菌的檢測80-814.結(jié)論81參考文獻(xiàn)81-84第五章巰基糖衍生物功能化的電化學(xué)生物傳感器用于活體腫瘤細(xì)胞外表多聚糖的競爭檢測84-1011.引言84-862.實(shí)驗(yàn)局部86-882.1試劑與儀器862.2細(xì)胞的培養(yǎng)與處理86-872.3{ConA-MWNT-HRP}生物復(fù)合物的制備872.4巰基糖衍生物的合成87-882.5巰基糖衍生物功能化的電化學(xué)生物傳感器的制備882.6酶放大的電化學(xué)檢測883.結(jié)果與討論88-983.1巰基糖衍生物功能化的電化學(xué)生物傳感器的表征88-903.2{ConA-MWNT-HRP}生物復(fù)合物的表征90-913.3巰基糖衍生物功能化的電化學(xué)生物傳感器的競爭檢測機(jī)理91-923.4檢測條件的優(yōu)化92-933.5不同電化學(xué)生物傳感器性能的比較93-943.6電化學(xué)檢測腫瘤細(xì)胞94-963.7腫瘤細(xì)胞外表甘露糖的檢測96-984.結(jié)論98參考文獻(xiàn)98-101第六章凝集素電化學(xué)生物傳感器用于活體腫瘤細(xì)胞外表多聚糖的檢測研究101-1161.引言101-1032.實(shí)驗(yàn)局部103-1042.1試劑與儀器1032.2{lectin-Au-Th}生物復(fù)合物的制備103-1042.3凝集素電化學(xué)生物傳感器的制備1042.4細(xì)胞外表多聚糖的電化學(xué)檢測1043.結(jié)果與討論104-1123.1{lectin-Au-