抗生素類藥物分析

抗生素類藥物分析第一節(jié)概述抗生素的定義

抗生素是細菌、放線菌和真菌等微生物的代謝產(chǎn)物，對各種病原微生物有強大的抑制或殺滅作用?？股氐膩碓?.生物合成（發(fā)酵）2.化學合成或半合成抗生素質(zhì)量的復雜性

產(chǎn)品穩(wěn)定性差分子結(jié)構(gòu)大多不穩(wěn)定，降解后療效下降、失效或增加毒副作用發(fā)酵過程不易控制易受污染生產(chǎn)工藝復雜發(fā)酵液中雜質(zhì)

無機鹽、脂肪、各種蛋白質(zhì)、各種降解產(chǎn)物、色素、熱原、毒性物質(zhì)增加異常毒性、細菌內(nèi)毒素、熱原、降壓物質(zhì)、無菌[檢查]含量測定方法（一）生物學方法測定抗生素抑菌或殺菌的能力優(yōu)點1、與臨床效果一致2、靈敏度高3、干擾物質(zhì)少缺點1、操作繁瑣2、培養(yǎng)時間長2、測定誤差大（二）化學及物理化學方法以理化方法測定主藥含量優(yōu)點1.準確度高2.簡單、快速1.不一定代表生物效價缺點2.易受雜質(zhì)干擾分類（按結(jié)構(gòu)與性質(zhì)）：

β–內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類、多肽類、抗腫瘤類林可霉素類、其他抗生素類第二節(jié)β–內(nèi)酰胺類抗生素

青霉素類頭孢菌素類青霉素（青霉素G、芐青霉素）氨芐西林

（氨芐青霉素）阿莫西林

（羥氨芐青霉素）普魯卡因青霉素頭孢氨芐頭孢拉定頭孢羥氨芐頭孢噻吩鈉酸性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、Na與堿金屬(Na+、K+)成鹽

（一）羧基易溶于水

與有機堿(普魯卡因)成鹽

難溶于水普魯卡因青霉素（二）手性C(5%頭孢唑啉鈉溶液–18～–24°)頭孢菌素類C6C7青霉素類C3C5C6

旋光性﹡﹡﹡﹡﹡

（三）共軛體系頭孢菌素類母核有共軛體系

青霉素類母核無明顯UV

多數(shù)有苯環(huán)取代基

UV青霉素鈉UV7-20（四）β–內(nèi)酰胺環(huán)水溶液不穩(wěn)定干燥純凈穩(wěn)定不穩(wěn)定性因素四元環(huán)張力大酰胺鍵易水解（某些金屬離子）（溫度）某些氧化劑例青霉素的降解反應青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸H2OpH2100℃α–青霉噻唑?；u胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2二、K+、Na+反應（一）鑒別

焰色→鮮黃色

+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+

焰色→紫色

+0.1%四苯硼鈉+Ac→↓白

K+（二）呈色反應1.羥肟酸鐵反應β-內(nèi)酰胺類NaOH呈色Fe3+/3H+H+Fe3+/3

（紅、棕、褐）2、與H2SO4-HNO3反應頭孢菌素類3.茚三酮反應△α-氨基α-氨基、伯胺某些羥基胺類酮式烯醇式茚三酮茚三酮縮合藍紫色4.雙縮脲反應β-內(nèi)酰胺類（開環(huán)分解）似肽鍵藍紫色5.與變色酸-硫酸反應活潑“-CH2-”青霉素阿莫西林氨芐西林△（分解）變色酸顯色150℃（縮合）（縮合）6.與重氮苯磺酸反應（偶合）酚羥基頭孢哌酮（偶合）7.與銅鹽反應橄欖綠色NaOH專屬反應（三）沉淀反應1.遇酸→↓在過量HCl或有機溶劑中溶解2.有機胺鹽反應（1）重氮化-偶合反應重氮化-偶合反應芳伯氨基普魯卡因普魯卡因青霉素（2）與三硝基苯酚反應△二芐基乙二胺mp三硝基苯酚光譜法（四）1、UV法樣品、分解產(chǎn)物Cu2+頭孢氨芐λmax=262nm青霉素V鈉

A280nm/A264nm=1.30～1.50Cu2+pH3.8△氯唑青霉素3410.682雙氯青霉素3420.653苯唑青霉素3391.328(nm)2、IR法β-內(nèi)酰胺環(huán)酰胺3、NMR法

利用不同結(jié)構(gòu)的原子核在D2O中有不同的NMR光譜進行鑒別JP以吸收峰頻率對峰強度進行作圖

主要研究原子核的磁化性質(zhì)及其在外磁場中的運動規(guī)律硫酸慶大霉素NMR譜7-08硫酸慶大霉素NMR色譜法（五）1、TLC法對照品對照法2、HPLC法

精密稱取樣品0.1009g，置250ml碘瓶中，加水10ml，振搖使溶解，精密加溴滴定液(0.1mol/L)25.0ml，再加鹽酸5ml，立即密塞并振搖1分鐘，在暗處靜置15分鐘后，注意微開瓶塞，加碘化鉀試液10ml，立即密塞，搖勻后，用硫代硫酸鈉滴定液（0.09863mol/L）滴定，至近終點時，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍色消失，消耗硫代硫酸鈉滴定液(0.09863mol/L)13.80ml，并將滴定結(jié)果用空白試驗校正，空白試驗消耗硫代硫酸鈉滴定液（0.09863mol/L）21.64ml。每1ml溴滴定液(0.1mol/L)相當于13.01mg的C12H17N2NaO3。酸性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、Na與堿金屬(Na+、K+)成鹽

（一）羧基易溶于水

與有機堿(普魯卡因)成鹽

難溶于水普魯卡因青霉素（二）手性C(5%頭孢唑啉鈉溶液–18～–24°)頭孢菌素類C6C7青霉素類C3C5C6

旋光性

（三）共軛體系頭孢菌素類母核有共軛體系

青霉素類母核無明顯UV

多數(shù)有苯環(huán)取代基

UV青霉素鈉UV7-20（四）β–內(nèi)酰胺環(huán)水溶液不穩(wěn)定干燥純凈穩(wěn)定不穩(wěn)定性因素四元環(huán)張力大酰胺鍵易水解（某些金屬離子）（溫度）某些氧化劑例青霉素的降解反應青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸H2OpH2100℃α–青霉噻唑?；u胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2(頭孢噻吩鈉水溶液25℃24h失活8%)二、K+、Na+反應（一）鑒別

焰色→鮮黃色

+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+

焰色→紫色

+0.1%四苯硼鈉+Acˉ→↓白

K+（二）呈色反應1.羥肟酸鐵反應β-內(nèi)酰胺類NaOH呈色Fe3+/3H+H+Fe3+/3

（紅、棕、褐）例：ChP(2000)頭孢哌酮[鑒別]

取本品10mg，加水2ml與鹽酸羥胺溶液[取34.8%鹽酸羥胺溶液1份，醋酸鈉-氫氧化鈉溶液1份，乙醇4份]3ml，振搖溶解后，放置5min，加酸性硫酸鐵銨試液1ml，搖勻，顯紅棕色。2、與H2SO4-HNO3反應頭孢菌素類3.茚三酮反應△α-氨基、伯胺某些羥基胺類酮式烯醇式茚三酮茚三酮縮合藍紫色4.雙縮脲反應β-內(nèi)酰胺類（開環(huán)分解）似肽鍵藍紫色5.與變色酸-硫酸反應活潑“-CH2-”青霉素阿莫西林氨芐西林△（分解）變色酸顯色150℃（縮合）（縮合）6.與重氮苯磺酸反應（偶合）酚羥基頭孢哌酮（偶合）7.與銅鹽反應橄欖綠色NaOH專屬反應（三）沉淀反應1.遇酸→↓在過量HCl或有機溶劑中溶解2.有機胺鹽反應（1）重氮化-偶合反應重氮化-偶合反應芳伯氨基普魯卡因普魯卡因青霉素（2）與三硝基苯酚反應△二芐基乙二胺mp三硝基苯酚光譜法（四）1、UV法樣品、分解產(chǎn)物頭孢氨芐λmax=262nm青霉素V鈉A280nm/A264nm=1.30～1.50Cu2+Cu2+pH3.8△氯唑青霉素3410.682雙氯青霉素3420.653苯唑青霉素3391.328(nm)2、IR法β-內(nèi)酰胺環(huán)酰胺3、NMR法

利用不同結(jié)構(gòu)的原子核在D2O中有不同的NMR光譜進行鑒別JP

主要研究原子核的磁化性質(zhì)及其在外磁場中的運動規(guī)律色譜法（五）1、TLC法對照品對照法2、HPLC法三、含量測定（水解）碘量法（一）1.原理水解產(chǎn)物定量過量剩余β-內(nèi)酰胺類ChP反應分兩步進行：1.水解反應(按化學計算量進行)2.氧化-還原反應(無固定的量關系，受溫度、PH值和時間等因素影響，應嚴格控制反應條件并采用標準品平行對照測定)第一步第二步例注射用普魯卡因青霉素含量測定

取裝量差異項下的內(nèi)容物，精密稱取約0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氫氧化鈉溶液1ml放置20分鐘，再加1mol/L鹽酸溶液1ml與醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.5)5ml，精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，搖勻，在20～25℃暗處放置20分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）滴定，至近終點時加淀粉指示液，繼續(xù)滴定并強力振搖，至藍色消失；另精密量取供試品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，搖勻，在暗處放置20分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）滴定，作為空白。同時用青霉素鈉對照品同法測定作對照，算出供試品的含量。V樣空V樣對照液+緩沖液+碘液+回滴+堿+酸+緩沖液+碘液+回滴V對空V對2.方法供試液+緩沖液+碘液+回滴+堿+酸+緩沖液+碘液+回滴

空白試驗A、消除樣品已降解產(chǎn)物的干擾B、消除樣品中其他消耗碘的雜質(zhì)的干擾C、消除碘揮發(fā)造成的誤差

以未經(jīng)水解的樣品作空白測定空白樣品I2Na2S2O3I-I2

采用標準品平行對照測定A、可消除溫度、pH、操作、環(huán)境等條件的影響B(tài)、使本法測定結(jié)果與微生物檢定法一致3.條件（1）弱酸性pH4.5堿↑I2→IO3-+I-酸↑普魯卡因與碘在酸性條件下會產(chǎn)生復鹽沉淀（2）溫度24～26℃溫度＞38℃

未水解的供試品亦消耗碘（3）水解時間以水解20分鐘后的耗碘量最大（4）反應時間反應20分鐘后，耗碘量隨時間的變化較小，可減小含量測定的誤差。4.特點（1）靈敏度高樣品:碘=1:8（2）反應條件、實驗操作要求高V對、V對空V樣、V樣空1份含量加試劑次序、反應時間、滴定速度相同4I2→8I-5.計算原料汞量法（二）1.原理（水解）青霉素族ChP2.方法醋酸鹽緩沖液pH4.6滴定水解pH4.6滴定樣品

以未經(jīng)水解的樣品作空白測定例青霉素鈉含量測定

取本品約50mg，精密稱定，加水5ml溶解后，加1mol/L氫氧化鈉溶液5ml，搖勻，放置15分鐘，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸鹽緩沖液(pH4.6)20ml及水20ml，搖勻，照電位滴定法(附錄ⅦA),用鉑電極為指示電極，汞-硫酸亞汞電極為參比電極，在35～40℃，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)緩慢滴定，（控制滴定過程約為15分鐘），不計第一個等當點，計算第二個等當點時消耗滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相當于7.128mg的總青霉素(按C16H17N2NaO4S計算)。另取本品約0.5g，精密稱定，加水與上述醋酸鹽緩沖液各25ml，振搖使完全溶解，在室溫下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，終點判斷方法同上.每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相當于7.128mg的降解物（按C16H17N2NaO4S計算）?？偳嗝顾氐陌俜趾颗c降解物的百分含量之差值即為青霉素的含量。3、討論（1）以第二次滴定突躍為終點電位法指示終點（2）反應摩爾比

1:1（3）空白試驗消除已降解產(chǎn)物干擾（4）優(yōu)點

不需標準品4、計算

精密稱取含水量為0.5%的青霉素鈉0.0502g，按藥典方法測定總青霉素含量時，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)6.97ml。另精密稱取上述樣品0.5013g，按藥典方法測定降解物含量時，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)1.33ml。以干燥品計算，求樣品中青霉素的含量。例青霉素鈉含量測定酸堿滴定法（三）1、原理△（鈉鹽）β-內(nèi)酰胺類ChP△2、方法△中和中和例苯唑西林鈉含量測定

取本品約0.5g，精密稱定，加新沸過的并用0.01mol/L氫氧化鈉溶液中和至酚酞指示液剛顯紅色的水20ml，使溶解,再用0.01mol/L氫氧化鈉溶液中和后，精密加氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)25ml，搖勻，置水浴中加熱20分鐘，注意避免吸收空氣中的二氧化碳，冷卻后，加酚酞指示液1～2滴，用鹽酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并將滴定結(jié)果用空白試驗校正。每1ml的氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)相當于40.14mgC19H19N3O5S。3、討論（1）水解前先中和溶劑和樣品（2）加熱時避免吸收CO2△不能使酚酞變紅（3）空白試驗校正(消除Na2CO3干擾)（4）特點簡便快速不適用于有殘留酯的產(chǎn)品（水解）可見-紫外分光光度法（四）1、酸水解法（銅鹽法）（1）原理穩(wěn)定劑JP青霉素族（2）方法△（3）特點實驗條件隨各藥物穩(wěn)定性不同而定標準品對照法（4）計算2、硫醇汞鹽法（1）原理（咪唑）青霉素族ChP咪唑（2）方法對照品法計算pH9例氨芐西林鈉含量測定

取本品約60mg置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置另一100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5ml，置25ml量瓶中，加硼酸緩沖液2.5ml與醋酐的乙腈溶液（1→50）0.25ml，放置5min后，加咪唑溶液至刻度，搖勻，置60℃水浴中，加熱30min，取出冷卻，照分光光度法（附錄ⅣA），在325nm的波長處測定吸收度；另取氨芐西林三水合物標準品，按同法測定，計算，即得。

（3）討論a.咪唑催化的水解產(chǎn)率高，硫醇汞鹽穩(wěn)定（≥3h）b.側(cè)鏈有-NH2時，需加醋酐先將其乙?；蟛拍馨l(fā)生上述反應pH9（4）特點A、簡便快速B、用標準品對照，重現(xiàn)性良好，RSD≤1%3、羥肟酸比色法USPJPFe3+/3H+紅色β-內(nèi)酰胺類NaOHHPLC法（五）ChP頭孢菌素類內(nèi)標法＋校正因子外標法特點快速、高效、靈敏專屬性強、重現(xiàn)性好

一法多用（鑒別、檢查、含測）哌拉西寧原料藥含量測定色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇–0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液–10％氫氧化四乙基銨溶液–水（400︰50︰3︰547）用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.5為流動相。檢測波長為254nm。第三節(jié)氨基糖苷類抗生素鏈霉素雙氫鏈霉素新霉素卡那霉素慶大霉素巴龍霉素鏈霉素鏈霉胍

+鏈霉糖

+N-甲基-L-葡萄糖胺

苷元糖鏈霉雙糖胺鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺慶大霉素

糖苷元絳紅糖胺+脫氧鏈霉胺+加洛糖胺

糖絳紅糖胺紫素胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺絳紅糖胺紫素胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺慶大霉素C復合物慶大霉素C1R=HR1、R2=CH3

慶大霉素C2R=R2=H

R1=CH3

慶大霉素C1aR、R1、R2=H

慶大霉素C2aR=CH3R1=R2=H

慶大霉素C2bR=R1=HR2=CH3一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)多與硫酸成鹽鏈霉素3個慶大霉素5個堿性中心堿性（一）水溶性溶解性（二）鏈霉素pH5～7.5慶大霉素pH2～12穩(wěn)定UV（三）穩(wěn)定性（四）鏈霉素水解產(chǎn)物反應（五）坂口反應N-甲基葡萄糖胺反應麥芽酚反應二、鑒別

茚三酮反應（一）△羥基胺結(jié)構(gòu)N-甲基葡萄糖胺反應（二）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+紅色（Elson-Morgan反應）(縮合)紅色對二甲氨基苯甲醛H+

麥芽酚反應（三）

鏈霉糖特有反應H+分子重排紫紅麥芽酚鏈霉胍特有反應（或α-萘酚）8-羥基喹啉坂口反應（四）α-萘酚（四）反應H+UV法（五）IR法（六）慶大霉素無UV吸收TLC法（七）三、檢查鏈霉素雜質(zhì)（一）鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）

方法TLC中的對照品法（BP）1.來源反應中間體對微生物的活性無明顯差異毒副作用和耐藥性不同發(fā)酵菌種不同工藝差別C組分比例不一致規(guī)定控制各組分的相對百分含量ChPUSPBPJP慶大霉素C組分的測定（二）λmax=330nm衍生化原理1.1-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物RP－HPLC方法2.規(guī)定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%計算3.峰面積歸一化法三、含量測定鏈霉素、慶大霉素微生物檢定法本法系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用量反應平行線原理的設計，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。四、血清中慶大霉素的HPLC法血漿樣品的預處理離子對色譜法的目的：除去氨基酸、肽、胺的干擾選用OPA為熒光衍生化試劑采用柱后衍生化法第四節(jié)四環(huán)素類抗生素ABCD123456789101112四環(huán)素（TC）tetracycline金霉素(CTC)

chlortetracycline氯四環(huán)素土霉素(OTC)

oxytetracycline氧四環(huán)素多西環(huán)素(DOTC)doxycycline脫氧土霉素美他環(huán)素（METC）metacycline一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)兩性（一）1.與酸、堿均能成鹽2.強酸或強堿中溶解度↑

酚羥基、烯醇型羥基弱酸性二甲胺基弱堿性吸濕性（二）多含結(jié)晶水與金屬離子生成有色配位化合物Ca2+Mg2+Fe3+Al3+

UV（三）與金屬離子絡合（四）pH3~7.5熒光

不穩(wěn)定性（四）1.差向異構(gòu)化淡黃→黑藍色熒光差向四環(huán)素（土霉素、多西環(huán)素不易差向異構(gòu)化）2.降解反應（1）酸性下降解λmax=445nmλmax=435nm橙黃色脫水四環(huán)素～～TCETCATCEATC＜＜（2）堿性下降解（熒光）二、鑒別試驗H2SO4反應（一）FeCl3反應（二）Cl-反應（三）1mol/L鹽酸-甲醇（1→100）0.01mg/mlUV法（四）熒光法（五）UV綠色熒光H+UVTLC法（六）正相分配薄層色譜IR法（五）EDTA克服痕量金屬造成的拖尾現(xiàn)象三、檢查·4-差向四環(huán)素（ETC）

·脫水四環(huán)素（ATC）

·差向脫水四環(huán)素（EATC）

·鹽酸金霉素（CTC）有關物質(zhì)（一）TLC法（1995版）HPLC法（2000版）標準品對照法鹽酸四環(huán)素四環(huán)素有關物質(zhì)TLC圖I.供試液(5mg/ml)ETC(0.2mg/ml)ATC(0.025mg/ml)IV.EATC(0.025mg/ml)CTC(0.1mg/ml)VI.混合液4％0.5％0.5％2％吸收度（二）雜質(zhì)吸收度四、含量測定ChP、USPHPLC法（外標法）系統(tǒng)適用性試驗1.防護柱2.預試溶液

4-差向脫水四環(huán)素四環(huán)素3.RSD≤2.0%JP比色法（標準曲線法）標△樣△原理1.熟悉抗生素類藥物分析的特點及其常規(guī)檢驗項目。了解抗生素類藥物的分析現(xiàn)狀，熟悉生物學法與物理化學法測定效價的原理及優(yōu)缺點。2.掌握β－內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、鑒別及含量測定。第十一章復習內(nèi)容3.掌握氨基糖苷類抗生素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及鑒別，了解其檢查及含量測定4.掌握四環(huán)素類抗生素的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，了解其鑒別、檢查及含量測定5.了解抗生素類藥物的質(zhì)量考察方法99：89．下列哪個藥物會發(fā)生羥肟酸鐵反應

A.青霉素

B.慶大霉素

C.紅霉素

D.鏈霉素

E.維生素C

99m：71．中國藥典(1995年版)測定頭孢菌素類藥物的含量時，多數(shù)采用的方法是

A.微生物法

B.碘量法

C.汞量法

D.正相高效液相色譜法

E.反相高效液相色譜法95：139．屬于-內(nèi)酰胺類的抗生素藥物有

A.青霉素

B.紅霉素

C.頭孢菌素

D.