rhorock通路在創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)再生中的作用機(jī)制

rhorock通路在創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)再生中的作用機(jī)制當(dāng)前1頁(yè)，總共34頁(yè)。立論依據(jù)創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）致死、致殘率很高，給社會(huì)家庭造成巨大損失。在美國(guó)每年約有1，700，000人遭受TBI，其中約52，000人死亡，直接和間接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)600億美元。我國(guó)每年約有10萬(wàn)人死于TBI，其中，因車(chē)禍死亡約5萬(wàn)人，這一數(shù)字也呈上升趨勢(shì)。當(dāng)前2頁(yè)，總共34頁(yè)。立論依據(jù)本課題為國(guó)家自然基金項(xiàng)目-“創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)源性機(jī)制及其干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究”的后續(xù)研究，著重討論Rho/Rock通路在TBI后神經(jīng)源性炎癥和神經(jīng)再生修復(fù)中的作用機(jī)制,探索新的干預(yù)措施，從新角度探求腦創(chuàng)傷后神經(jīng)修復(fù)的新治療策略和方案。當(dāng)前3頁(yè)，總共34頁(yè)。立論依據(jù)本研究采用TBI大鼠模型，以腦組織內(nèi)NF-κB等為神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)的指標(biāo)，腦細(xì)胞線粒體、神經(jīng)突觸等超微結(jié)構(gòu)變化為神經(jīng)病理?yè)p傷指標(biāo)，Nogo-A等為阻礙神經(jīng)再生的指標(biāo)，BDNF等為促進(jìn)神經(jīng)再生的指標(biāo)，探究該通路在調(diào)控神經(jīng)再生中的作用機(jī)制當(dāng)前4頁(yè)，總共34頁(yè)。立論依據(jù)機(jī)制假設(shè)：TBI激發(fā)神經(jīng)源性炎癥，激活Rho/Rock通路，致球蛋白輕鏈磷酸化酶（MLCP）活性受抑制，引起腦血管平滑肌收縮，血流下降，內(nèi)皮及屏障功能受損，導(dǎo)致腦組織缺血，阻礙神經(jīng)再生，腦血管周?chē)仔晕镔|(zhì)滲出增加，引發(fā)血管性、細(xì)胞性腦水腫和腦細(xì)胞調(diào)亡。使用Rho激酶、NF-κB抑制劑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等干預(yù)措施，松弛血管平滑肌，擴(kuò)張血管，促進(jìn)腦組織血供，改善神經(jīng)再生微環(huán)境,這為T(mén)BI的早期干預(yù)和康復(fù)治療提供了新思路。當(dāng)前5頁(yè)，總共34頁(yè)。圖1Rho/Rock經(jīng)典信號(hào)通路Rho/Rock信號(hào)通路的成分主要有三個(gè)：小G蛋白(在這里主要是指Rho)、與Rho相連的Rho激酶(Rho-kinase)和Rho-kinase的效應(yīng)分子[3-5]。當(dāng)前6頁(yè)，總共34頁(yè)。研究目標(biāo)（1）探討Rho/ROCK信號(hào)通路在TBI后神經(jīng)源性炎癥中的作用機(jī)制；（2）研究Rho/ROCK信號(hào)通路在控TBI后中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)微環(huán)境的作用及其機(jī)制；（3）觀察多種干預(yù)措施對(duì)Rho/ROCK信號(hào)通路的影響及其在治療TBI中的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前7頁(yè)，總共34頁(yè)。（1）通過(guò)免疫組化和電鏡觀測(cè)Rho、ROCK、NF-κB、BDNF、NOGO-A等在對(duì)照組（假手術(shù)組）及實(shí)驗(yàn)組（顱腦損傷動(dòng)物模型組）SD大鼠大腦皮層、下丘腦、垂體、腦干、損傷處及周邊區(qū)腦組織中的分布特征和定位規(guī)律，以尋找組織學(xué)根據(jù)；（2）通過(guò)分子生物學(xué)手段（如PCR）測(cè)定對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠大腦皮層、下丘腦、垂體、腦干、損傷處及其周邊腦細(xì)胞中Rho、ROCK、NF-κB、BDNF、NOGO-A等的基因表達(dá)水平。（3）取大鼠大腦中動(dòng)脈（MCA）做Rho激酶活性、MLCP活性、MLCK活性及MLC磷酸化水平測(cè)定。（4）觀察干預(yù)措施（Rho激酶抑制劑）對(duì)上述（1）~（3）變化的影響；（5）上述幾項(xiàng)中改變和變化的相關(guān)性分析。研究?jī)?nèi)容當(dāng)前8頁(yè)，總共34頁(yè)。（1）未干預(yù)TBI組：

實(shí)驗(yàn)采用SD大白鼠（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重270-290g，烏拉坦腹腔注射（1.2mg·kg-1）麻醉滿意后，將大鼠固定在腦立體定位儀上（ST-T型，日本成貿(mào)公司）。制作TBI模型時(shí)沿正中線切開(kāi)頭皮并剝離骨膜,切口長(zhǎng)2cm，暴露右頂骨，牙科臺(tái)式電鉆(寧波醫(yī)療器械廠)于冠狀縫后1.5mm,中線右旁2.5mm處鉆一直徑為5mm的圓形骨窗,保持硬腦膜完整，將撞桿頭端置骨窗處,擊錘（重20g）沿外周導(dǎo)管分別從10cm、30cm高處自由落下沖擊撞桿,造成右頂葉輕、中度腦挫傷,另用擊錘（重40g）沿外周導(dǎo)管從25cm高處自由落下沖擊撞桿,造成右頂葉重度腦挫傷,致傷沖擊力分別為0.028N·s、0.048N·s和0.088N·s，硬膜保持完整，骨蠟封閉骨窗。TBI組按損傷程度分為輕、中、重三組。于傷后0.5、6、12、24、48、72h斷頭取血，開(kāi)顱取腦，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)方法當(dāng)前9頁(yè)，總共34頁(yè)。當(dāng)前10頁(yè)，總共34頁(yè)。①免疫組化和電鏡觀測(cè)Rho、ROCK、NF-κB、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、NOGO-A等在對(duì)照組（假手術(shù)組）及實(shí)驗(yàn)組（顱腦損傷動(dòng)物模型組）SD大鼠大腦皮層、下丘腦、垂體、腦干、損傷處及周邊區(qū)腦組織中的分布特征和定位規(guī)律，以尋找組織學(xué)根據(jù)；②通過(guò)分子生物學(xué)手段（PCR）測(cè)定對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠大腦皮層、下丘腦、垂體、腦干、損傷處及其周邊腦細(xì)胞中Rho、ROCK、NF-κB、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、NOGO-A、等的基因表達(dá)水平；取大鼠大腦中動(dòng)脈（MCA）做Rho激酶活性、MLCP活性、MLCK活性及MLC磷酸化水平測(cè)定。實(shí)驗(yàn)方法當(dāng)前11頁(yè)，總共34頁(yè)。（2）干預(yù)TBI組：撞擊鼠腦后使用Rho激酶抑制劑（HydrochlorideFasudil、Y-30141

）、NF-KB抑制劑-PDTC、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等對(duì)TBI組上述3項(xiàng)改變的影響。各種干預(yù)措施（如Rho激酶抑制劑-Y-30141

、NF-KB抑制劑）對(duì)神經(jīng)損傷修復(fù)的影響（3）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上述各項(xiàng)中改變和變化的相關(guān)性分析。實(shí)驗(yàn)方法當(dāng)前12頁(yè)，總共34頁(yè)。技術(shù)路線圖當(dāng)前13頁(yè)，總共34頁(yè)。擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題（1）大鼠大腦中動(dòng)脈的分離，需要顯微鏡下仔細(xì)操作，技術(shù)要求高，我科實(shí)驗(yàn)室有實(shí)驗(yàn)用手術(shù)顯微鏡并有老師指導(dǎo)，仍需要不斷練習(xí)，提高顯微操作技能。（2）各種干預(yù)措施（如Rho激酶抑制劑-Y-30141

、NF-KB抑制劑）對(duì)神經(jīng)損傷修復(fù)的影響，國(guó)內(nèi)外前期研究少，需要不斷摸索實(shí)驗(yàn)條件。4-氨基吡啶類（Y-30141）異喹啉類（H-1152P）當(dāng)前14頁(yè)，總共34頁(yè)。（1）項(xiàng)目的設(shè)計(jì)構(gòu)思是建立在以往工作基礎(chǔ)上，是國(guó)家自然基金的后續(xù)深入研究，現(xiàn)已建立了穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)方法，并且已開(kāi)展有關(guān)方面的研究，得到初步結(jié)果；（有前期研究基礎(chǔ)）（2）本項(xiàng)目采用成熟的動(dòng)物模型，成熟的分子生物學(xué)、放射免疫學(xué)、病理學(xué)技術(shù)；（在方法學(xué)方面是可行的）（3）本人的指導(dǎo)老師和項(xiàng)目組成員有長(zhǎng)期科研實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，為本課題提供技術(shù)和理論指導(dǎo)；（4）項(xiàng)目申請(qǐng)人所在學(xué)科有專用實(shí)驗(yàn)室，所在實(shí)驗(yàn)室和所在單位擁有課題相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，導(dǎo)師課題經(jīng)費(fèi)充足，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及相關(guān)試劑均可購(gòu)買(mǎi)到。（實(shí)驗(yàn)條件具備，可以確保實(shí)驗(yàn)如期完成）可行性分析當(dāng)前15頁(yè)，總共34頁(yè)。（1）關(guān)于Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在TBI后神經(jīng)源性炎癥中的作用機(jī)制目前尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。（2）關(guān)于Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控TBI后神經(jīng)再生和功能修復(fù)微環(huán)境中的作用機(jī)制，目前尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。（3）關(guān)于多種干預(yù)方法（Rho激酶抑制劑、NF-KB抑制劑、NPY-受體阻抑、NK1-受體阻抑、干細(xì)胞細(xì)胞移植等）在顱腦損傷期對(duì)Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響機(jī)制，尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。創(chuàng)新點(diǎn)當(dāng)前16頁(yè)，總共34頁(yè)。（1）2015年01月份～2015年4月份：完成假手術(shù)組的免疫組化、電鏡和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。（2）2015年5月份～2015年8月份：完成顱腦損傷未干預(yù)組的免疫組化、電鏡和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。（3）2015年9月份～2015年12月份：完成顱腦損傷干預(yù)組的免疫組化、電鏡和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。（4）2016年1月份～2015年3月份：建立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，總結(jié)課題，撰寫(xiě)論文，發(fā)表有關(guān)論文，準(zhǔn)備論文交流與答辯。研究進(jìn)度當(dāng)前17頁(yè)，總共34頁(yè)。（1）Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在TBI后神經(jīng)源性炎癥中發(fā)揮重要作用，腦血管Rho激酶含量與腦組織NF-ΚB表達(dá)水平之間存在相關(guān)性；（2）Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控TBI后神經(jīng)再生和功能修復(fù)微環(huán)境中發(fā)揮樞紐作用，腦血管Rho激酶與促進(jìn)和抑制神經(jīng)再生的因子（如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和NOGO-A）之間存在相關(guān)性；（3）Rho激酶抑制劑通過(guò)干預(yù)Rho/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)減輕TBI的嚴(yán)重程度、促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)方面能起一定作用，為臨床治療TBI提供新思路和新方法。（4）成果以論文形式發(fā)表預(yù)期成果當(dāng)前18頁(yè)，總共34頁(yè)。經(jīng)費(fèi)預(yù)算金額（萬(wàn)元）計(jì)算根據(jù)及理由支出預(yù)算合計(jì)5一、設(shè)備費(fèi)0.31．購(gòu)置費(fèi)0.0

2．試制費(fèi)0.3預(yù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物費(fèi)用二、能源材料費(fèi)3.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑費(fèi)用三、資料及印刷費(fèi)1.2發(fā)表論文、檢索、裝訂論文、復(fù)印資料等費(fèi)用六、其他費(fèi)用0.0參考文獻(xiàn)：當(dāng)前19頁(yè)，總共34頁(yè)。參考文獻(xiàn)：1.TraumaticBrainInjuryintheUnitedStates:EmergencyDepartmentVisits,Hospitalizations,andDeaths,2002-2006./TraumaticBrainInjury/index.html2.王忠誠(chéng).神經(jīng)外科學(xué).湖北：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2005.3653.FujimuraM,UsukiF,KawamuraM.InhibitionoftheRho/ROCKpathwaypreventsneuronaldegenerationinvitroandinvivofollowingmethylmercuryexposure.ToxicolApplPharmacol.2011,250(1):1-9.4.ChengR,ShaoMY,YangH.TheeffectoflysophosphatidicacidandRho-associatedkinasepatterningonadhesionofdentalpulpcells.IntEndodJ.2011,44(1):2-8.5.HaydontV,BourgierC,Vozenin-BrotonsMC.Rho/ROCKpathwayasamoleculartargetformodulationofintestinalradiation-inducedtoxicity.BrJRadiol.2007,80(1):S32-40.6.ZhouQ,GenschC,LiaoJK.Rho-associatedcoiled-coil-formingkinases(ROCKs):potentialtargetsforthetreatmentofatherosclerosisandvasculardisease.TrendsPharmacolSci.2011,32(3):167-173.7.HallA,LalliG.RhoandRasGTPasesinaxongrowth,guidance,andbranching.ColdSpringHarbPerspectBiol.2010，2(2):a001818.8.BryanBA,DennstedtE,MitchellDC.RhoA/ROCKsignalingisessentialformultipleaspectsofVEGF-mediatedangiogenesis.FASEBJ.2010,24(9):3186-3195.9.HuE,LeeD.Rhokinaseaspotentialtherapeutictargetforcardiovasculardiseases:opportunitiesandchallenges.ExpertOpinTherTargets.2005，9(4):715-736.10.ChengHL,SuSJ,HuangLW.ArecolineinducesHA22T/VGHhepatomacellstoundergoanoikis-involvementofSTAT3andRhoAactivation.MolCancer.2010,9:126.11.GoupilE,TassyD,BourguetC,.AnovelbiasedallostericcompoundinhibitorofparturitionselectivelyimpedestheprostaglandinF2alpha-mediatedRho/ROCKsignalingpathway.JBiolChem.2010,285(33):25624-25636.12.MonceauV,PasinettiN,SchuppC.ModulationoftheRho/ROCKpathwayinheartandlungafterthoraxirradiationrevealstargetstoimprovenormaltissuetoxicity.CurrDrugTargets.2010,11(11):1395-1404.13.KogataN,TribeRM,F?sslerR.Integrin-linkedkinasecontrolsvascularwallformationbynegativelyregulatingRho/ROCK-mediatedvascularsmoothmusclecellcontraction.GenesDev.2009,23(19):2278-2283.14.TanimoriY,TsubakiM,YamazoeY.Nitrogen-containingbisphosphonate,YM529/ONO-5920,inhibitstumormetastasisinmousemelanomathroughsuppressionoftheRho/ROCKpathway.ClinExpMetastasis.2010Oct;27(7):529-538.當(dāng)前20頁(yè)，總共34頁(yè)。歡迎各位老師提出寶貴意見(jiàn)謝謝！當(dāng)前21頁(yè)，總共34頁(yè)。當(dāng)前22頁(yè)，總共34頁(yè)。答辯項(xiàng)目背景材料當(dāng)前23頁(yè)，總共34頁(yè)。Rho蛋白R(shí)ho蛋白:Rho蛋白是G蛋白中的一種，是屬于小G蛋白超家族成員，其分子量約20～30Kd，由氨基酸序列高度同源3種異構(gòu)體組成：RhoA、RhoB、RhoC。當(dāng)前24頁(yè)，總共34頁(yè)。Rho蛋白的兩種形式轉(zhuǎn)化機(jī)制Rho蛋白以活化的Rho-GTP形式和非活化的Rho—GDP形式兩種狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中、質(zhì)膜上[6-8]。當(dāng)前25頁(yè)，總共34頁(yè)。ROCK的一級(jí)功能結(jié)構(gòu)A、晶體結(jié)構(gòu)B、整體結(jié)構(gòu)C示意圖Rho—kinase(ROCK):ROCK，即Rho激酶，屬于絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一，以兩種同源性極高的異構(gòu)體存在：ROCKII(ROCKα)和ROCKI(ROCKβ)。Rho激酶包括一個(gè)催化區(qū)(位于分子結(jié)構(gòu)的N端)，一個(gè)螺旋區(qū)(位于分子結(jié)構(gòu)的中間部分)及一個(gè)pleckstrin同源區(qū)(PH區(qū)，位于分子結(jié)構(gòu)的C端)。Rho激酶的Rho結(jié)合區(qū)(Rho—binding，RB)位于螺旋區(qū)的C端。Rho—GTP與螺旋區(qū)的C端相互作用，并激活Rho激酶的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。Rho激酶的C端(包括RB和PH區(qū))為激酶的負(fù)向調(diào)節(jié)區(qū)。在靜息狀態(tài)下，RB和PH區(qū)與激酶的催化區(qū)相互作用，并抑制激酶的活性。激活狀態(tài)的Rho與RB相互作用，改變了Rho激酶的構(gòu)型，從而解除RB和PH對(duì)激酶的抑制，Rho激酶被激活。激酶缺失C端區(qū)，包括PH區(qū)或PH與螺旋區(qū)，可使激酶持續(xù)激活。某些化學(xué)制劑，如Y-227632、HAl077(fasudil)或hydroxyfasudil等，能夠以與ATP競(jìng)爭(zhēng)的方式特異性地抑制Rho激酶的活性。它們與ATP競(jìng)爭(zhēng)Rho激酶催化區(qū)的ATP結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制Rho激酶的活性[9-11]。當(dāng)前26頁(yè)，總共34頁(yè)。ROCK活性的調(diào)節(jié)Rho-kinase的效應(yīng)分子:當(dāng)Rho蛋白被激活，就轉(zhuǎn)移到特定的細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)上，它們將與下游效應(yīng)分子交互作用，激發(fā)特定的信號(hào)級(jí)聯(lián)。至今，有70多個(gè)蛋白被鑒定屬于Rho蛋白的下游效應(yīng)分子。Rho激酶的下游底物雖然很多，但是被深入研究的并不是很多。其中球蛋白輕鏈磷酸化酶(myosinlight．chainphosphase，MLCP)是目前研究得最多也是最清楚的Rho激酶作用的底物之一。MLCP的肌球蛋白結(jié)合亞基(myosin．bindingsubunit，MBS)是第一個(gè)被確認(rèn)的Rho激酶的底物。MLCP包括3個(gè)亞基：MBS，37kDa的l型磷酸化酶催化亞基、肌球蛋白結(jié)合亞基(MBSl30k)即磷酸酶靶蛋白I(MYPT-1)調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)功能不明的小M20非催化亞基。MLCP通過(guò)MBS與磷酸化的肌球蛋白輕鏈(myosinlightchain，MLC)結(jié)合，并使其脫磷酸。Rho激酶激活后可磷酸化MBS，從而導(dǎo)致MLCP失活。Rho激酶還可以直接磷酸化MLC。當(dāng)前27頁(yè)，總共34頁(yè)。Rho激酶活化的病理過(guò)程所以，Rho激酶可通過(guò)直接磷酸化MLC及使MLCP失活兩種途徑調(diào)節(jié)MLC的磷酸化水平。Rho激酶激活后MLCP的活性受到抑制，導(dǎo)致MLC磷酸化水平升高和平滑肌細(xì)胞收縮，內(nèi)皮細(xì)胞收縮，還有一個(gè)Rho激酶的作用底物研究也較多：內(nèi)皮源性一氧化氮合酶(endothelialNOsynthase，eNOS)。目前研究認(rèn)為組織缺血等可使Rho激酶活化，使eNOS下調(diào)，引起血管收縮，血流下降，內(nèi)皮功能及屏障受損[12-15]。當(dāng)前28頁(yè)，總共34頁(yè)。TBI后Rho／Rock信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如何被激活并在神經(jīng)源性炎癥及神經(jīng)再生修復(fù)中發(fā)揮作用的呢？我們認(rèn)為，Rho／Rock信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活是一個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程。在靜息狀態(tài)下，Rho激酶的Rho結(jié)合結(jié)構(gòu)域和PH結(jié)構(gòu)域與Rho激酶的催化結(jié)構(gòu)域相互作用，從而抑制了激酶的活性。Rho蛋白以活化的Rho-GTP形式和非活化的Rho-GDP形式兩種狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中、質(zhì)膜上。當(dāng)TBI時(shí)，機(jī)械能刺激、氧自由基、神經(jīng)源性炎癥中的致炎物質(zhì)、細(xì)胞因子等作用于細(xì)胞膜上G蛋白偶聯(lián)受體，進(jìn)而Rho被活化后，并發(fā)生膜轉(zhuǎn)位：即從胞漿中游離的GDP結(jié)合的失活狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP結(jié)合的活化狀態(tài)并結(jié)合至細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)面的受體區(qū)域，活化的Rho將信號(hào)傳遞給Rock，Rock接受活化信號(hào)后，其分子中的854位絲氨酸和697位蘇氨酸磷酸化而激活，活化的Rho激酶一方面失活LIM激酶介導(dǎo)的confilin(一種分割肌動(dòng)蛋白的蛋白質(zhì))而調(diào)制肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。另一方面Rho通過(guò)Rho激酶與MBS結(jié)合使其磷酸化，從而抑制MLC磷酸脂酶的活性。失活的肌球蛋白磷酸酶不能將MLC脫磷酸化，使得細(xì)胞漿內(nèi)磷酸化MLC水平上升，MLC的磷酸化能誘導(dǎo)II型肌球蛋白構(gòu)象變化，使其與肌動(dòng)蛋白的相互作用增加，肌動(dòng)—肌球蛋白交聯(lián)增加，從而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合，細(xì)胞發(fā)生收縮。MLC磷酸化水平在平滑肌細(xì)胞中直接決定著細(xì)胞的收縮功能，而在非平滑肌細(xì)胞中則控制肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合動(dòng)力學(xué)。細(xì)胞的移動(dòng)、趨化、黏附與收縮都是通過(guò)微絲骨架的聚合與延伸來(lái)實(shí)現(xiàn)的。于是Rho／Rock信號(hào)通路就是通過(guò)這樣一個(gè)復(fù)雜的磷酸化／脫磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)微絲骨架的聚合，控制細(xì)胞的多種生物學(xué)行為信息轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移以及炎性細(xì)胞的黏附、吞噬等。若Rho／Rock信號(hào)通路激活發(fā)生在TBI后的腦血管上，一方面可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）收縮，細(xì)胞間距增大，EC屏障功能受損,從而使血管通透性增加，使大量富含蛋白質(zhì)的液體及炎性介質(zhì)滲入組織間隙，造成腦水腫；另一方面，也會(huì)導(dǎo)致血管平滑?。╒SM）細(xì)胞的舒張功能障礙，引起損傷區(qū)及其周邊腦血管收縮，血供減少，進(jìn)一步引起鄰近腦組織缺血缺氧，加重腦水腫，導(dǎo)致顱壓增高，甚至腦疝死亡。當(dāng)前29頁(yè)，總共34頁(yè)。Rho/Rock信號(hào)通路不僅在TBI后神經(jīng)源性炎癥中起著中心樞紐作用，而且在TBI后的腦神經(jīng)元和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)方面也扮演著重要的角色。許多國(guó)內(nèi)外研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境是影響中樞神經(jīng)功能恢復(fù)的主要因素[16-20]，干細(xì)胞治療腦損傷也需要在良好的微環(huán)境中才有可能獲得良好的效果。腦損傷后，在損傷部位及其周?chē)仔约?xì)胞的浸潤(rùn)和膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕的形成，是影響干細(xì)胞替代原有腦神經(jīng)元發(fā)揮相應(yīng)功能的主要障礙，甚至還可能引起癲癇發(fā)作等異常腦電活動(dòng)疾病。我們知道，腦損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境中阻礙神經(jīng)元樹(shù)突軸突再生的分子包括：硫酸軟骨素（來(lái)自于膠質(zhì)瘢痕中反應(yīng)性增生的膠質(zhì)細(xì)胞）、少突膠質(zhì)細(xì)胞分泌的髓磷脂和髓鞘的殘片、髓鞘相關(guān)性糖蛋白（MAG）、神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制因子（Nogo-A）、少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白多糖（Omgp）、ephrinB3、Sema4D等[21-23]（見(jiàn)圖7）。促進(jìn)神經(jīng)元樹(shù)突軸突再生的分子包括：神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NGF）、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（CNTF）、膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）、白血病抑制因子（LIF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）等，其中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子又包括：神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3（NT-3）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4/5（NT-4/5）等[24-26]。當(dāng)前30頁(yè)，總共34頁(yè)。上述起阻礙和促進(jìn)神經(jīng)元樹(shù)突軸突再生的兩類分子如何發(fā)揮作用，調(diào)控自身神經(jīng)元、移植神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的修復(fù)進(jìn)程？我們認(rèn)為，Rho/Rock信號(hào)通路在調(diào)控腦損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境阻礙和促進(jìn)神經(jīng)元樹(shù)突軸突再生的兩類分子表達(dá)及數(shù)量增減中起著關(guān)鍵作用。由于Rho/Rock信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在TBI后神經(jīng)源性炎癥中起著中心樞紐作用，而炎癥反應(yīng)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷修復(fù)的微環(huán)境起著主導(dǎo)作用，因此該通路對(duì)腦損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)的微環(huán)境勢(shì)必產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響到TBI后腦神經(jīng)元和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)。研究Rho/Rock信號(hào)通路在TBI后神經(jīng)源性炎癥中的作用機(jī)制，對(duì)如何控制腦損傷后炎癥反應(yīng)對(duì)腦神經(jīng)元和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)的影響、如何創(chuàng)造一個(gè)良好的神經(jīng)再生的微環(huán)境、如何早期干預(yù)，最大限度地盡早修復(fù)受損的腦神經(jīng)元和重建正常的中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)有重要意義。當(dāng)前31頁(yè)，總共34頁(yè)。我們對(duì)TBI后引起的腦損傷過(guò)程及其創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)理進(jìn)行探討研究，提出以下假設(shè)：

TBI后，機(jī)械能刺激、神經(jīng)源性炎性物質(zhì)、氧自由基等激活Rho/Rock信號(hào)通路，致球蛋白輕鏈磷酸化酶（MLCP）活性受抑制，引起腦血管平滑肌收縮，血流下降，內(nèi)皮及屏障功能受損，導(dǎo)致腦組織缺血，阻礙神經(jīng)再生，腦血管周?chē)仔晕镔|(zhì)滲出增加，引發(fā)血管性、細(xì)胞性腦水腫和腦細(xì)胞調(diào)亡。使用Rho激酶抑制劑（如HydrochlorideFasudil[27]，Y-27632[28]等）、NF-κB抑制劑（如pyrrolidinedithiocarbarnate，PDTC[29-30]等）和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（如NGF、BDNF、NT-3）等干預(yù)措施，松弛血管平滑肌，擴(kuò)張血管，促進(jìn)腦組織血供，改善神經(jīng)再生微環(huán)境。這為T(mén)BI的早期干預(yù)和康復(fù)治療提供了新思路。當(dāng)前32頁(yè)，總共34頁(yè)。本人及其研究成員正在進(jìn)行的該方面預(yù)實(shí)驗(yàn)，并已有前期工作基礎(chǔ)，我們研究了TBI時(shí)腦組織不同部位NF-κB含量及表達(dá)情況，結(jié)果顯示，TBI后損傷處周邊腦細(xì)胞中NF-κB基因表達(dá)水平、神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制因子Nogo-A實(shí)驗(yàn)組明顯較對(duì)照組增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組下丘腦間質(zhì)疏松，部分神經(jīng)元樹(shù)突不清，細(xì)胞核漿界限模糊，著色較深呈毛玻璃樣，部分神經(jīng)元紅色變性，細(xì)胞周?chē)锌諘灛F(xiàn)象，并可見(jiàn)少量小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬神經(jīng)元現(xiàn)象（嗜神經(jīng)現(xiàn)象），以及毛細(xì)血管周?chē)g隙開(kāi)放。這說(shuō)明TBI后發(fā)生了神經(jīng)源性炎癥，致腦細(xì)胞NF-κB等炎性物質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)，Nogo-A表達(dá)增加，激發(fā)了Rho/Rock信號(hào)通路，最終引起細(xì)胞性腦水腫及血管源性腦水腫。我們將進(jìn)一步研究TBI后炎性因子、縮血管物質(zhì)、促凋亡因素、Rho激酶抑制劑、抗炎因子、痛覺(jué)干預(yù)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的影響。系統(tǒng)、深入研究將有助于我們更全面、確切地認(rèn)識(shí)和了解Rho/Rock信號(hào)通路在TBI中的病理學(xué)作用，具有一定的學(xué)術(shù)價(jià)值和臨床實(shí)用意義。當(dāng)前33頁(yè)，總共34頁(yè)。參考文獻(xiàn)：1.TraumaticBrainInjuryintheUnitedStates:EmergencyDepartmentVisits,Hospitalizations,andDeaths,2002-2006./TraumaticBrainInjury/index.html2.王忠誠(chéng).神經(jīng)外科學(xué).湖北：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2005.3653.FujimuraM,UsukiF,KawamuraM.InhibitionoftheRho/ROCKpathwaypreventsneuronaldegenerationinvitroandinvivofollowingmethylmercuryexposure.ToxicolApplPharmacol.2011,250(1):1-9.4.ChengR,ShaoMY,YangH.TheeffectoflysophosphatidicacidandRho-associatedkinasepatterningonadhesionofdentalpulpcells.IntEndodJ.2011,44(1):2-8.5.HaydontV,BourgierC,Vozenin-BrotonsMC.Rho/ROCKpathwayasamoleculartargetformodulationofintestinalradiation-inducedtoxicity.BrJRadiol.2007,80(1):S32-40.6.ZhouQ,GenschC,LiaoJK.Rho-associatedcoiled-coil-formingkinases(ROCKs):potentialtargetsforthetreatmentofatherosclerosisandvasculardisease.TrendsPharmacolSci.2011,32(3):167-173.7.HallA,LalliG.RhoandRasGTPasesinaxongrowth,guidance,andbranching.ColdSpringHarbPerspectBiol.2010，2(2):a001818.8.BryanBA,