高效液相色譜法應用講座

關于高效液相色譜法應用講座第一頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四HPLC實驗操作應知HPLC操作操作流程流動相的配制色譜柱使用與維護實驗操作注意事項檢測器數(shù)據(jù)處理第二頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四1概述

定義分離模式與主要分離機制基本術語正相與反相色譜HPLC的特點問題思考第三頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四定義HPLC——用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。第四頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四儀器結構簡介儀器組成根據(jù)需要配置流動相在線脫氣裝置、梯度洗脫裝置、自動進樣系統(tǒng)、柱后反應系統(tǒng)等。第五頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四泵輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質量和分析結果的可靠性。輸液泵應具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應＜0.5%，這對定性定量的準確性至關重要；②流量范圍寬，分析型應在0.1~10ml/min范圍內連續(xù)可調，制備型應能達到100ml/min；③輸出壓力高，一般應能達到150~300kg/cm2；④液缸容積小；⑤密封性能好，耐腐蝕。

第六頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四泵的使用和維護注意事項

①防止任何固體微粒進入泵體，常用的方法是濾過，輸液泵的濾器應經常清洗或更換。

②流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。

③溶劑瓶內的流動相被用完。

④輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產生漏液。

第七頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四附：高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質）2．高壓泵（輸液泵）3．進樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置泵第八頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四1.2HPLC分離模式與主要分離機制分離模式主要保留機制液-固吸附吸附劑的表面吸附鍵合相溶質在兩相間的分配或溶質與極性固定相的吸附離子交換溶質離子與填料上的反電荷層之間的相互作用離子對電中性離子對在兩相間的分配分子排阻基于流體動力學體積的過濾作用手性溶質手性異構體與填料手性作用點間非對應異構體相互作用。親和溶質與固定化配體間生化專屬結合第九頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四正相色譜法與反相色譜法

正相色譜法

反相色譜法

第十頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四正相與反相

正相色譜法

反相色譜法

固定相極性

高～中

中～低

流動相極性

低～中

中～高

組分洗脫次序

極性小先洗出

極性大先洗出

第十一頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四正相：流動相極性↑，洗脫能力↑，k↓，組分tR↓反相：流動相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑第十二頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四1.3特點

適用范圍寬：現(xiàn)在絕大部分化學類藥品皆可采用該儀器分析。分離效率高：復方分析、輔料干擾時等情況下，更顯示其威力。速度快：一般出峰時間均在30min以內。第十三頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四靈敏度高：可檢測物質達10-9g左右，一般最低檢測濃度均可達10-1~10-3μg/ml（進樣體積10~20μl）。并可通過使用不同的檢測器，測定不同物質，或再提高測定靈敏度。第十四頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四色譜柱可反復使用：一般保存好，均可達2年以上。流出的組分容易收集：可用于制備色譜或價格極為昂貴的物質收集。第十五頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四

安全：僅有一些有機溶劑的污染（使用時，流動相口要密封，一者以免揮發(fā)，流動相中各組分比例不準，二者防止揮發(fā)，污染環(huán)境），比氣相要安全的多。

第十六頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四1.4思考1、為什么說分離度與重復性是系統(tǒng)適應性試驗指標中是更具有實用意義的參數(shù)？2、影響柱效的因素有哪些？3、影響分離度的因素有哪些？4、影響重復性的因素有哪些？Rs儀器第十七頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四影響分離的因素1．第十八頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四思考psi、bar、Mpa如何換算？乙醇為什么不常用作流動相？第十九頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四2、HPLC操作操作流程開機最后開檢測器配制流動相流動相平衡，在此過程和適當時候調節(jié)柱溫、流速、流動相比例。必要時要選柱子。配制對照品、樣品溶液。系統(tǒng)適應性試驗進樣數(shù)據(jù)處理關機先關檢測器，后沖洗第二十頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四流動相的配制流動相應具有的特點流動相脫氣流動相過濾除去微粒流動相貯存流動相極性與截止波長流動相調pH值思考題第二十一頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四流動相具備以下的特點：

a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。

b、流動相具有一定惰性，與樣品不產生化學反應(特殊情況除外)。

c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。

第二十二頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

e、流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。

第二十三頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四流動相為什么要脫氣流動相使用前必須進行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過程中當流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會造成熒光猝滅。

第二十四頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四常用的脫氣方法比較氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。

加熱回流法：效果較好，但操作復雜，且有毒性揮發(fā)污染。

抽真空脫氣法：易抽走有機相。

第二十五頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四常用的脫氣方法比較超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。

在線真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機利用膜滲透技術，在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。第二十六頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四壓力、溫度與氣泡壓力減少時要產生氣泡溫度升高時要產生氣泡第二十七頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四防止產生新的氣泡沿管壁緩緩倒入先混合后脫氣梯度洗脫預先“部分混合”第二十八頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四為什么要濾除微粒為什么溶劑和樣品要過濾?

色譜柱：由于填料顆粒很細，色譜柱內腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會使色譜柱和毛細管容易堵塞。

儀器：溶劑和樣品中的細小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內的藍寶石活塞桿和活塞的磨損。要正確選用濾膜第二十九頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四流動相的貯存流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，并在3天內使用，用前應重新濾過。第三十頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四流動相的貯存容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。第三十一頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四6，流動相常用溶劑的極性和截止波長由極性可以看出，在反相色譜中，要使出峰時間加快，可增加流動相中的乙腈比例，但要注意分離度的減?。蝗粢钩龇鍟r間減慢，可增加流動相中水的比例，增加水的比例還會引起分離度的增加；兩者之間綜合來考慮。四氫呋喃使用時注意波長。必須選用色譜級的。

第三十二頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四

由于甲醇的極限波長為210nm左右，故短波長測定時，最好不要采用甲醇，而用乙腈。

樣品稀釋用溶劑的選擇：測定有關物質時最好選用流動相，避免以溶劑峰的干擾，水往往出倒峰。各溶劑截止波長第三十三頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四流動相的pH值

采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節(jié)流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。對于弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。第三十四頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。第三十五頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四流動相的配制緩沖鹽溶液濃度不要配錯，臨用新配調PH時一般在水相調，當流動相中有機相比例較高時無法調。第三十六頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四思考題1、流動相流速與組成與保留時間的關系如何？2、流速與柱效、峰面積的關系3、乙腈與甲醇在應用上的區(qū)別。4、水與有機相混合比例不同，會引起粘度變化嗎？5、流動相有時為什么要調pH？6、流動相配好后可用多長時間？第三十七頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四色譜柱的使用與維護閱讀說明書安裝時注意方向如何排氣泡？反相柱C-18或C8當用含緩沖鹽或表面活性劑的流動相后，要沖洗干凈。第三十八頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四色譜柱的使用與維護色譜柱不用、存放時，兩頭柱塞一定塞住，防止柱內溶劑揮干,否則容易揮發(fā)干損傷柱子。分析生化樣品、血液制品和手性色譜柱時，最好加一預柱以保護。流動相極性及流速（壓力）不要突變。第三十九頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四（1）色譜柱不能夠碰撞、彎曲或強烈震蕩；安裝時，一定要保證閥件或管路的清潔。（2）盡量不使用或少使用高粘度的流動相。（3）在滿足靈敏度的情況下，盡可能使用小進樣量。如果樣品比較“臟”，要進行凈化或提純處理。第四十頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四柱溫控制柱溫箱的作用：1、保留時間精確再現(xiàn)2、提高分離效率3、對高分子化合物或黏度大的樣品，分析時柱溫必須高于室溫。4、對一些具有生物活性的生物分子，要求低的柱溫第四十一頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四系統(tǒng)平衡1.除上所述外，流動相配制時還需注意什么？2.流動相沖洗多長時間平衡？如何平衡？3.有表面活性劑時小流速過夜，再到規(guī)定流速30min。4.基線什么情況下才算平衡？第四十二頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四配制樣品和對照品溶液2．配制：①溶劑；②容器：塑料容器常含有高沸點的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收。3對照品稱量問題

第四十三頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四預試預試目的n，R是否符合要求；保留時間是否合適調節(jié)色譜條件流動相組成流速柱溫柱子

第四十四頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。

當選用最佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。第四十五頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四流速和柱溫均可適當改變，以適應測定的需要。如含量測定時，可適當加大流速和提高柱溫；改變柱溫和流速降低均可提高分離效果。第四十六頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四第一次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數(shù)及是否還有雜質峰在較長時間內才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。

第四十七頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四4．進樣量：藥品標準中常標明注入10ul而目前多數(shù)HPLC系統(tǒng)采用定量環(huán)（10ul、20ul和50ul），因此應注意進樣量是否一致。（可改變樣液濃度）第四十八頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四系統(tǒng)適應性試驗含量測定對照品2份,樣品2份;有關物質,對照品一份,樣品一份。每份對照品進樣三次，計算RSD%。系統(tǒng)適應性符合要求后，再進樣?；蛘咭环輰φ掌废冗M5針，計算RSD%符合要求，實驗過程或實驗結束進另一份對照品核對，范圍應在98%~102%之間第四十九頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四樣品測定含量測定樣品2份，每份1針;有關物質樣品1份,每份2針。為了考察系統(tǒng)在實驗過程中的穩(wěn)定性。適當間隔再進標樣核對。有關物質檢查時，空白應進1針。含量測定可不做。自身對照進幾針？第五十頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四10.3．應盡量保持樣品溶液和對照品溶液使用同一溶劑。含量測定時一般可以做到，溶出度測定時，往往有所差異，通過先濃配后，再用該溶劑稀釋的辦法進行，比例盡可能小。第五十一頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四儀器沖洗如何沖洗一般溶劑緩沖梯度第五十二頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四檢測器類型最通用的紫外檢測器：注意測定波長較短時，基線有可能會飄；洗柱子時，盡量關閉光源，以延長使用壽命。二極管陣列檢測器：目前使用者越來越多。用于多波長檢測、峰純度測定、對被測定物質進行紫外掃描后選擇波長等用途。

第五十三頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四

10.二極管陣列檢測器的應用

采用二極管陣列檢測器進行論證，也是目前常采用的一個強有力的手段。它通過對一個色譜峰的數(shù)點進行紫外掃描，然后比較所得到的掃描圖譜的接近程度從而評價被檢測峰的純度。

第五十四頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四利用二極管陣列檢測器進行峰純度檢查的缺點：（1）雜質濃度低，或與主成分相比吸收太小，達不到檢測靈敏度，無法檢測出來。（2）當雜質的發(fā)色團與主成分一致，或者說雜質與主組分有相同或幾乎相同的光譜圖且具相近的流出時間，此時雜質也無法發(fā)現(xiàn)。第五十五頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四熒光檢測器：靈敏度更高，對那些μg級的制劑品種，有時適用。但缺點是，基線穩(wěn)定需平衡時間較長。示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學檢測器（電導檢測器）等。第五十六頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四檢測最小峰面積的設定峰純度的測定自身對照法與歸一化法的區(qū)別結果計算第五十七頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四8．定量分析8.1外標法：計算公式：

使用時應注意盡量保持樣品溶液和對照品溶液濃度相同第五十八頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四

8.2內標法：計算公式：第五十九頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四8.3歸一化法和自身對照法：為有關物質（雜質）的測定方法。這是通過峰面積的比較來推算出各物質質量比例的方法。目前多采用自身對照法來進行。(1)歸一化法：即一個峰的峰面積（雜質峰）占總峰面積或占主峰面積的多少。由于有關物質測定時，總峰面積的絕大部分均為主峰面積，故兩者結果差不多，結果基本一致。第六十頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四(2)自身對照法：通常是將供試品溶液稀釋一定倍數(shù)后（通常為100倍）作為對照溶液（這里對照溶液與對照品溶液的區(qū)別需要強調一下），將其和供試品溶液分別進樣測定，供試品溶液色譜圖中的每個雜質峰面積，與對照溶液主成分峰面積進行比較或計算進行對雜質的判斷。如比較，直接比峰面積大小，如計算，則采用公式計算雜質含量。第六十一頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四如果該物質線性關系良好，稀釋100倍，峰面積還呈線性的話，那么，歸一化法和自身對照法所得結果基本是一致的（最多差0.02%左右）。但如果稀釋100倍，峰面積不呈線性的話，那么，歸一化法和自身對照法所得結果將有所差異，如此時采用歸一化法，將得不到較為正確的結果，因為此時，峰面積已不能較為準確地表示質量；而采用自身對照法，則可避免該情況的發(fā)生，這也是目前推薦采用該法的原因所在。第六十二頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四用紫外檢測器，一般化合物的線性范圍可達1~106或107，但也有一些測定物質，線性范圍較窄，此時便需要摸索其范圍，但又不能單純考慮線性范圍，還應著重考慮供試品溶液的濃度才是最為重要的。第六十三頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四制劑測定中注意事項：1.紫外鑒別中輔料的干擾，易使最大吸收波長偏離。2.含量均勻度采用先加水浸泡使溶漲，再超聲使崩散，再加有機溶劑使主藥溶解的辦法進行，準確、可靠、易行。第六十四頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四3.溶出度測定時如靈敏度不夠，可通過加大進樣量的辦法解決。對照品溶液配制、測定值偏高、過濾損失等問題一定要注意。4.含量測定濃度設定得盡可能低些。測定值與投料量的吻合性。色譜條件可與有關物質測定時的不一致。第六十五頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四5.有關物質注意輔料的影響，可規(guī)定主峰保留時間幾倍前的輔料峰不計。單個雜質的設定。6勿需去除薄膜衣、糖衣！第六十六頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四2.5中國藥典具體品種存在問題舉例：1.甲硫酸新斯的明注射液含量測定采用定氮法；BP同品種采用UV、E值法測定，方法簡便、易行。2.甲磺酸酚妥拉明及其注射液含量測定均采用沉淀法，經多次操作后測定，該法費時費力，且易造成損失、使結果偏低；BP和USP同品種均采用氫氧化四丁基銨直接滴定的方法，操作簡便、易行。第六十七頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四克霉唑含量測定采用對照品、容量分析滴定法測定。但未給出滴定度，故滴定時不知該選用何種體積的滴定管和大約消耗的體積數(shù)，使試驗人員需經多次試驗進行摸索，浪費了人力、物力。4.酮康唑乳膏 含量測定采用有機溶劑多次提取，費時費力，且必造成一定的損失（至少5%）。應改為采用甲醇破壞基質、溶解主藥后，離心，取上清液直接進行HPLC法測定，結果準確、可靠，便于操作。第六十八頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四5.鹽酸布比卡因注射液 含量測定極為煩瑣，費時費力；BP和USP同品種采用HPLC法測定，方法簡便、易行。6.提高辦法，及時更改、完善!第六十九頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四思考：下圖說明什么？第七十頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四找原因如圖所示：同一份溶液進樣兩次。怎么會多出一個峰第七十一頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四同一樣品兩份溶液，各自進樣，出現(xiàn)圖示結果什么原因？第七十二頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四找原因圖示：上圖為空白溶劑。中圖為樣品溶液。下圖為自身對照。什么原因？第七十三頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四主峰不見了右圖為空白溶劑圖譜實驗人員說在樣品的圖譜上主峰不見了，怎么回事？第七十四頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四提高分離度有什么途徑？①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當α＝1時，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a.改變流動相的組成及pH值；b.改變柱溫c.改變固定相。第七十五頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四提高分離度有什么途徑？③改變容量因子。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調節(jié)流動相的組成來實現(xiàn)。k2趨于0時，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k2在1~10范圍內，最好為2~5，窄徑柱可更小些。

第七十六頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四為什么要梯度洗脫樣品的保留范圍寬樣品分子量樣品中含強保留成份樣品稀溶液的柱上濃縮第七十七頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四梯度洗脫時應注意什么問題？①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心第七十八頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四

②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產生氣泡。第七十九頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四梯度洗脫時應注意什么問題？③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。

第八十頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四梯度洗脫時應注意什么問題？④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始狀態(tài)。1.在100%B結果運行一定時間(2~5個柱體積)以洗脫干擾物,或在每次分析結束后,快速自最終B%結果運行一梯度至于100%B并維持一段時間柱平衡:指用起始流動相沖洗色譜柱達到兩相平衡。在每次進樣前，用同方法及時間平衡色譜柱。方法：5~10柱體積（7~15ml，對150mm?4.6mm）。也可用反梯度平衡穩(wěn)固需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經色譜柱，使固定相與初始流動相達到完全平衡。

第八十一頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四梯度洗脫時，基線為什么漂移在梯度洗脫中，基線漂移是常見的，尤其是低檢測波長時更為嚴重。這是由于A和B溶劑UV吸收不同造成的。這種UV吸收相關的漂移可用吸收匹配法消除。向A溶劑加UV吸收物。注意：用UV低波長及高靈敏度檢測時，運行空白試驗，在色譜圖中常常會出現(xiàn)一些“非樣品峰，這些峰來自流動相及污染的色譜系統(tǒng)。第八十二頁，共九十三頁，編輯于2023年，星期四與檢測器有關的故障及其排除1）流動池內有氣泡

如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會在基線上出現(xiàn)許多線狀"峰"，這是由于系統(tǒng)內有氣泡，需要對流動相進行充分的除氣，檢查整個色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅除系統(tǒng)內的氣泡。如果氣泡停留在流動池內，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（最好不連接色譜柱）；第八十三頁