實驗六堿法提取質(zhì)粒

實驗六堿法提取質(zhì)粒第1頁/共35頁實驗六堿法提取質(zhì)粒

轉(zhuǎn)到目錄第2頁/共35頁目錄返回標(biāo)題

一．目的二．原理附：原理示意圖三．試劑四．器材五．注意事項六．操作步驟1六．操作步驟2六．操作步驟3GFPuv質(zhì)粒的信息圖片GFPuvvector’sDescriptionLocationoffeatures1Locationoffeatures2Locationoffeatures3Locationoffeatures4Vector’sPrimerLocationPropagationinE.coli第3頁/共35頁一．目的了解提取質(zhì)粒的原理。學(xué)習(xí)和掌握質(zhì)粒提取的方法和技術(shù)。

——三個基本步驟：細(xì)菌的生長和質(zhì)粒的擴(kuò)增菌體的收集裂解及質(zhì)粒DNA的分離質(zhì)粒DNA的純化返回目錄返回目錄第4頁/共35頁二．原理

質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子，它能在細(xì)菌中垂直遺傳并且賦予宿主細(xì)胞一些表型。質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介，這種基因的運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基體的實驗技術(shù)。質(zhì)粒的提取是利用質(zhì)粒DNA與染色體DNA分子大小不同和性質(zhì)的差異性進(jìn)行的。染色體DNA比質(zhì)粒DNA大得多，且是線狀分子易斷，經(jīng)加熱或堿處理后容易變性并產(chǎn)生沉淀，即使冷卻或堿性被中和后也不可能復(fù)性，與變性蛋白質(zhì)及細(xì)胞碎片一起沉淀析出。質(zhì)粒DNA是共價結(jié)合的環(huán)狀分子，不會因加熱或堿處理等被折開，加熱冷卻或恢復(fù)中性PH后又呈天然構(gòu)型，溶解在溶液中。這樣通過加熱或堿處理后又中和PH，再用離心的方法就可把質(zhì)粒DNA提取出來。☆原理示意圖返回目錄第5頁/共35頁☆原理示意圖返回目錄

返回原理第6頁/共35頁三．試劑1.LB培養(yǎng)基detail2.STEdetail

3.溶液I

detail4.溶液Ⅱdetail5.溶液IIIdetail6.

3M乙酸鈉(pH5.2)

detail7.TE(pH8.0)detail

返回目錄第7頁/共35頁

LB培養(yǎng)基

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配制1升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入：細(xì)菌培養(yǎng)基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g細(xì)菌培養(yǎng)基用酵母提取物(bacto-yeastextract)5gNaCl

10g搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，5mol/LNaOH(約0.2ml)調(diào)節(jié)pH值至7.0,加入去離子水至總體積為1L，15lbf/in2(1.034×105Pa)高壓下蒸汽滅菌20分鐘。第8頁/共35頁STE

back

0.1mol/LNaCl

10mmol/LTris·Cl(pH8.0)

1mmol/LEDTA(pH8.0)

在15lbf/in2(1.034×105Pa)高壓下蒸汽滅菌20分鐘。第9頁/共35頁溶液I

back50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895×104Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘，保存于4℃。

第10頁/共35頁溶液II

back0.2mol/LNaOH(從5mol/L貯存液中現(xiàn)用稀釋)1%SDS第11頁/共35頁溶液III

back5mol/L乙酸鉀 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液重鉀的濃度為3mol/L，乙酸根的濃度為5mol/L。第12頁/共35頁3M乙酸鈉(pH5.2）

back在800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2，加水定容到1L，分裝后高壓滅菌。

第13頁/共35頁0.5mol/LEDTA(pH8.0)在800ml水中加入186.1gEDTA-Na·2H2O，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0(約20gNaOH顆粒)，然后定容至1L，分裝后高壓滅菌。1mol/LTris·Cl(pH8.0)在800ml水中加入121.1gTris-base，溶解后加濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，定容至1L，分裝后高壓滅菌。第14頁/共35頁TE(pH8.0)

back10mmol/LTris·Cl(pH8.0)

1mmol/LEDTA(pH8.0)

第15頁/共35頁50×TAE242gTris堿57.1冰乙酸100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)1×TAE0.04mol/LTris-乙酸0.001mol/LEDTA(pH8.0)第16頁/共35頁四．器材1.恒溫?fù)u床2.超凈工作臺3.離心機(jī)4.電泳儀和電泳槽5.玻璃器皿與耗材量筒、三角瓶、平皿;EP管(1.5ml,0.5ml);槍頭(1ml,0.2ml,10μl);牛皮紙、紗布、牙簽等返回目錄第17頁/共35頁五．操作步驟1

挑選一個單菌落，接種到含適當(dāng)抗生素的3mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)14~16小時。取1.2ml菌液，12,000rpm離心1分鐘，收集菌體。加入500μl~1mlSTEbuffer，渦旋打勻，12,000rpm離心1分鐘，收集菌體。加入預(yù)冷的溶液I100μl，渦旋振蕩充分懸浮，分散，混勻，冰浴5分鐘(重懸細(xì)胞)。加入200μl溶液Ⅱ(現(xiàn)配)，快速輕柔顛倒幾次，直至溶液澄清，保持冰浴(堿變性染色體DNA、蛋白質(zhì))。在5分鐘內(nèi)，加入溶液III150μl，輕柔顛倒5~10次，冰浴10分鐘（利用pH差異，復(fù)性質(zhì)粒DNA）返回目錄第18頁/共35頁五．操作步驟2

12,000rpm離心10分鐘，沉淀染色體DNA，及不溶的變性蛋白，取上清。上清液用Tris-HCl飽和苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提1-2次，每次劇烈振蕩20秒，12,000rpm離心5分鐘，可見溶液分三層，上層為質(zhì)粒DNA溶液，中層為蛋白層，下層為酚層。上清液用氯仿：異戊醇（24：1）抽提一次，12,000rpm離心10分鐘。上清液加入1/10體積3MNaAc，2倍體積無水乙醇，混勻后，室溫放置10-15分鐘。在12,000rpm離心10分鐘得到質(zhì)粒DNA沉淀。返回目錄第19頁/共35頁五．操作步驟3

去上清，加入1ml75%乙醇，洗滌沉淀。12,000rpm離心10分鐘。去上清，吸出痕量剩余乙醇，風(fēng)干。加入30~50μlddH2O或TE（pH8.0），溶解質(zhì)粒。加入RNaseA使終濃度為20μg/ml，室溫放置30分鐘~1小時。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提質(zhì)粒DNA純度及濃度。取1-5μlDNA樣品，加水稀釋至1ml，混勻后轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中，測定OD260及OD280，并計算OD260/OD280比值和DNA濃度：

DNA濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×50/1000（μg

/μl）返回目錄第20頁/共35頁分次收集4ml菌液離心，留沉淀第21頁/共35頁五．操作步驟4

瓊脂糖（1%）凝膠電泳稱取一定量瓊脂糖凝膠，按1g中100ml的量加入1×TAE，微波爐中加熱約2min，使瓊脂糖溶解；溶液冷至60℃，加入EB至終濃度為0.5μg/ml，混勻，注意戴手套操作；將瓊脂糖倒入電泳板中，使凝膠厚度約為0.3-0.5cm，迅速插上梳子，檢查有無氣泡；待凝膠完全凝固后（約30min），小心取出梳子，將凝膠板置于電泳槽中，加入1×TAE電泳buffer，讓液面高出膠面1mm；在DNA樣品中加入1/6loadingbuffer，混勻后用移液槍將樣品加入樣品孔中電泳，電壓降選擇為1-5V/cm（長度以兩個電極之間的距離計算）；根據(jù)指示劑的位置，判斷是否終止電泳。返回目錄第22頁/共35頁pGFPpBSKM第23頁/共35頁六．注意事項

為提高質(zhì)粒產(chǎn)量，要注意下面兩個步驟：加入溶液I后，渦旋振蕩應(yīng)充分打散菌體使之均勻懸??；加溶液II裂解要完全(快速輕柔顛倒5~10次)

，使蛋白質(zhì)和核酸變性；加溶液III后PH要達(dá)到中性(輕柔振蕩5~10次)，使質(zhì)粒DNA復(fù)性，這樣才能使質(zhì)粒DNA與染色體DNA完全分開，否則，難分開，所以裂解和復(fù)性這兩步要從嚴(yán)掌握。返回目錄第24頁/共35頁周四：熟悉實驗原理及步驟，清洗三角瓶、量筒等器皿，裝槍頭，1.5/0.5ml離心管，裝牙簽及配溶液等

50×TAE:500ml0.5mol/LEDTA(pH8.0):500ml1mol/LTris.Cl(pH8.0):500ml0.1mol/LCaCl2:500mlddH2O:每組100ml

5mol/L

NaOH:100ml

配LB培養(yǎng)基液體：全班1000ml150ml×4瓶（Amp+）(終濃度為60μg/ml)，用于兩個質(zhì)粒的接種100ml×4瓶(Amp-)，留做感受態(tài)細(xì)胞固體（含1.5%瓊脂粉）：每組100ml，共1500ml，可一起配再分裝每組倒5個平板（Amp+），用于次周轉(zhuǎn)化滅菌。七．實驗安排第25頁/共35頁周五：用Kit提取質(zhì)粒DNA，倒瓊脂糖凝膠板（1%），進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和濃度測定每人分別提取pGFPuv、pBSK質(zhì)粒各一管，每管60μl取1-2μl電泳，1-5μl用ddH2O稀釋后在紫外分光光度計下測OD260及OD280，并計算濃度對質(zhì)粒酶切過夜周六：酶切樣品瓊脂糖凝膠（1%）電泳用Kit對酶切后的DNA（pBSK大片段和GFP基因片段）片段進(jìn)行膠回收每組用一個柱子回收電泳檢測膠回收情況，用紫外檢測回收DNA的濃度后，存放于-20℃冰箱中七．實驗安排---續(xù)第26頁/共35頁第27頁/共35頁GFPuv質(zhì)粒的信息圖片返回目錄第28頁/共35頁GFPuvvector’sDescriptionpGFPuvcarriesthe“cycle3”variantofGFPdescribedbyCramerietal.(1).ThisgenewasclonedbetweenthetwoMCSsofthepUC19derivativepPD16.43(2).TheGFPuvgenecanbeeasilyexcisedfrompGFPuv.Alternatively,theGFPuvcodingsequencecanbeamplifiedbyPCR.TheGFPuvgenewasinsertedinframewiththelacZinitiationcodonfrompUC19sothatab-galactosidase-GFPuvfusionproteinisexpressedfromthelacpromoterinE.coli.Note,however,thatifyouexcisetheGFPuvcodingsequenceusingarestrictionsiteinthe5'MCS,theresultingfragmentwillencodethenative(i.e.,non-fusion)GFPuvprotein.ThepUCbackboneofpGFPuvprovidesahighcopynumberoriginofreplicationandampicillinresistancegeneforpropagationinE.coli.返回目錄第29頁/共35頁GFPuvvector’sLocationoffeatures1?lacpromoter:95–178CAPbindingsite:111–124–35region:143–148;–10region:167–172Transcriptionstartpoint:179lacoperator:179–199?lacZ-GFPuvfusionproteinexpressedinE.coliRibosomebindingsite:206–209Startcodon(ATG):217–219;Stopcodon:1003–1005?5'MCS:234–281返回目錄第30頁/共35頁GFPuvvector’sLocationoffeatures2?GFPuvgene

Startcodon(ATG):289–291;Stopcodon:1003–1005GFPchromophore:481–489wtGFPcDNAsequences(3):289–454SyntheticGFPgenewith"cycle3"mutationsfrompBAD-GFPuv(1):455–1007Cycle3mutationF99S(T?C):584Cycle3mutationM153T(T?C):7Cycle3Cycle3mutationV163A(T?C):776Cycle3silentmutationinL137(T?C):699Cycle3silentmutationinT225(A?T):963Q80Rmutation(A?G)(4):527返回目錄第31頁/共35頁GFPuvvector’sLocationoffeatures3?GFPuvgeneArgcodonsoptimizedforE.coli:R73(AgA?CgT):505–507,R96(AgA?CgC):574–576,R12(AgA?CgT):652–654,R168(AgA?CgC):790–792,R1215(AgA?CgT):931–933Silentmutations(CccA?TccG)creatingBspEIsite:510&513Silentmutation(A?G)creatingMluIsite:612Silentmutations(TtGgaA?CtCgaG)creatingXhoIsite:709,711&714Silentmutations(AG?TC)creatingBamHIsite:811–812Silentmutation(C?G)creatingSalIsite:894