核醫(yī)學(xué)-體外分析技術(shù)

體外分析技術(shù)

核醫(yī)學(xué)科

體外分析技術(shù)

利用放射分析或非放射分析技術(shù)測(cè)定生物樣品中微量生物活性物質(zhì)含量的一類分析法。體外放射分析技術(shù)放射性競爭結(jié)合分析:放射免疫分析（RIA)

放射性非競爭結(jié)合分析:免疫放射分析（IRMA)

受體放射配基結(jié)合分析(RBA)22023/3/30體外非放射分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光分析時(shí)間分辨熒光分析酶免疫分析32023/3/30

放射免疫分析

（Radioimmunoassay,RIA）

概念是利用特異抗體與標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原的競爭結(jié)合反應(yīng)，通過測(cè)定復(fù)合物放射性來計(jì)算非標(biāo)記抗原的量的一種超微量分析技術(shù)。1959年Berson和Yalow首先報(bào)導(dǎo)人體血漿內(nèi)源性胰島素的免疫分析。1977年榮獲諾貝爾獎(jiǎng)。52023/3/30原理基本原理是競爭結(jié)合反應(yīng)

*Ag+Ab*AgAb+*Ag(free)+Ag

AgAb+Ag(free)62023/3/30*Ag和Ag與Ab具有相同的結(jié)合能力，當(dāng)Ab的量有限時(shí)，相互競爭，相互抑制。Ag和*Ag與Ab結(jié)合的量取決于兩者的濃度比。遵循質(zhì)量作用定律。*Ag與Ab的結(jié)合率隨著Ag的量的增加而減少，呈負(fù)相關(guān)。反之亦然。原理72023/3/30將結(jié)合型B(Ag?Ab和*Ag?Ab)與游離型F(Ag和*Ag)分離開，分別測(cè)定其放射性，則B/F與Ka和待測(cè)Ag呈函數(shù)關(guān)系。用已知的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)Ag與一定量的*Ag和Ab作用，即可測(cè)得在各種標(biāo)準(zhǔn)濃度下的B/F比值，以此繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)被測(cè)Ag的B/F比值，就可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出相應(yīng)的該抗原的含量。原理82023/3/30

Ag+AbAgAb

反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)

Ka==K1為Ag與Ab結(jié)合速率常數(shù)

K2為Ag與Ab解離速率常數(shù)

Ka為平衡常數(shù)或親和力常數(shù)K1K2K1K2[Ag?Ab][Ag][Ab]數(shù)學(xué)模式92023/3/30

數(shù)學(xué)模式若Ag0及Ab0分別代表抗原及抗體的初始濃度，則平衡時(shí)：

[Ag]=[Ag0]-[Ag?Ab][Ab]=[Ab0]-[Ag?Ab]B/F=[Ag?Ab]/[Ag](B/F)2+(1+Ka[Ag0]-Ka[Ab0])B/F-Ka[Ag0]=0Ka為常數(shù)，[Ab0]為固定值，Ag0=*Ag+Ag，*Ag為設(shè)定的量。B/F與未標(biāo)記Ag之間呈函數(shù)關(guān)系。102023/3/30基本方法:主要試劑特異抗體

高親和力(affinity):Ag與Ab結(jié)合的能力。

高特異性(specificity):不易發(fā)生交叉反應(yīng)。

高滴度(titer):所需抗體量少,雜質(zhì)干擾少。標(biāo)記抗原

1)與待測(cè)物同一物質(zhì);2)生物活性不變;3)核素半衰期長;4)高比活度、放化純度。標(biāo)準(zhǔn)品（非標(biāo)記抗原）112023/3/30常用液相分離技術(shù):

收集抗原抗體復(fù)合物（B）雙抗體沉淀法:

分離完全，非特異結(jié)合小，環(huán)境影響小，效價(jià)高，但成本高.聚乙二醇(PEG)沉淀法:

快速，價(jià)廉，來源方便，受環(huán)境影響大葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法122023/3/30常用液相分離技術(shù)：

收集游離抗原(F)活性炭吸附法:

吸附游離部分，適用于分離小分子游離抗原?？焖?、簡便、準(zhǔn)確性差.葡聚糖包被活性炭(DCC)

增強(qiáng)吸附和減少解離，常使用?；钚蕴柯?lián)結(jié)氧化鐵制備DCC.132023/3/30常用液相分離技術(shù):

固相法固相分離法按材料（塑料、纖維素、凝膠顆粒）不同，有試管法、微粒法等。固相分離法是RIA近年來發(fā)展較快的領(lǐng)域試管固相法：抗體吸附在塑料試管上吸附量小，重現(xiàn)性差等微粒法和微球法：吸附量大等。142023/3/30基本步驟加樣：系列反應(yīng)管中加入相同劑量的*Ag、Ab，不同劑量標(biāo)準(zhǔn)Ag或一定量樣品。孵育：反應(yīng)達(dá)到平衡所需孵育時(shí)間溫度不同。分離結(jié)合及游離部分：測(cè)放射性：125I、3H數(shù)據(jù)處理：以B/F為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)Ag濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)樣品的濃度。152023/3/30放免分析的優(yōu)點(diǎn)靈敏度高特異性強(qiáng)精確度高162023/3/30缺點(diǎn)同位素的半衰期短，試劑盒不宜較長時(shí)間儲(chǔ)存。125I標(biāo)記抗原,輻射自分解影響標(biāo)記物的穩(wěn)定性，時(shí)間過長標(biāo)記物可脫碘和變性。放射性漲落引起樣本的計(jì)數(shù)誤差。反應(yīng)時(shí)間長，難以做到快速和自動(dòng)化檢測(cè)。廢物處理帶來許多不便。172023/3/30質(zhì)量控制（qualitycontrol，QC)對(duì)分析工作的誤差進(jìn)行經(jīng)常性的檢查，遇有質(zhì)量異常及時(shí)采取對(duì)策，以保證分析誤差控制在可接受的范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控系統(tǒng)誤差：某一系統(tǒng)變化，整批樣品受影響。隨機(jī)誤差：隨機(jī)現(xiàn)象，只對(duì)某一管或某一樣品影響。實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)控：地區(qū)性或全國性對(duì)各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果比較182023/3/30免疫放射分析

(Immunoradiometricassay,IRMA)192023/3/30原理

Ag+Ab*=Ag*Ab+*Ab(free)過量的*Ab與Ag結(jié)合形成Ag*Ab復(fù)合物，通過免疫吸附劑除去游離*Ab。Ag*Ab復(fù)合物的放射性與Ag的量成正相關(guān)。非競爭結(jié)合反應(yīng)。應(yīng)用過量*Ab，能測(cè)定低濃度Ag，靈敏度提高。202023/3/30基本方法夾心法：被測(cè)配體中加入固相抗體，再加標(biāo)記抗體，形成Ab1-Ag-Ab2復(fù)合物，用洗滌去除未結(jié)合的游離*Ab。測(cè)定復(fù)合物的放射性活度能代表被測(cè)配體的量。212023/3/30特點(diǎn)易于標(biāo)記：標(biāo)記物為抗體，結(jié)構(gòu)相同，125I標(biāo)記方便反應(yīng)速度快:非競爭結(jié)合反應(yīng)，標(biāo)記抗體過量，易達(dá)平衡靈敏度高：無不確定因素，靈敏度提高10~100倍。工作范圍寬：特異性高：單克隆抗體精密度好：加樣誤差主要來自抗原一個(gè)環(huán)節(jié)222023/3/30缺點(diǎn)至少兩株抗體：主要限于肽類和蛋白質(zhì)，很多小分子半抗原不能應(yīng)用。緩沖液PH及離子強(qiáng)度要求嚴(yán)格。應(yīng)用CEA、AFP、鐵蛋白、HbsAg、ACTH、PHA、胰島素、FSH，TSH、降鈣素、血管緊張素I&II、抗血友病因子、凝血VIII因子等。232023/3/30IRA與IRMA的區(qū)別

反應(yīng)類型結(jié)合類型標(biāo)記物待測(cè)物RIA免疫反應(yīng)競爭結(jié)合抗原抗原IRMA免疫反應(yīng)非競爭抗體抗原242023/3/30受體放射配基結(jié)合分析

（Radioligandbindingassay,RBA）252023/3/30

受體特性受體(receptor,R)是蛋白質(zhì)，是細(xì)胞蛋白組分。配體(ligand,L)是與受體特異結(jié)合的物質(zhì)。R與L具有極高的識(shí)別能力和高度親和力。R與L結(jié)合可觸發(fā)相應(yīng)的生理反應(yīng)或藥理效應(yīng)。具有飽和性、可逆性及符合質(zhì)量作用定律。262023/3/30R+*LR*L受體與配基的結(jié)合反應(yīng)非競爭性的結(jié)合反應(yīng)核素標(biāo)記配基分析受體的數(shù)量和性質(zhì)原理272023/3/30根據(jù)R*L的放射性和*L的比活度推算受體數(shù)量利用Scatchard作圖法求出受體的親和力常數(shù)，反映受體的性質(zhì)。通過測(cè)定類似物或阻斷劑競爭受體的能力可測(cè)定其特性。282023/3/30飽和曲線292023/3/30Scatchard作圖[RT][RT]KD1KD302023/3/30離體RBA基本方法制備標(biāo)本(亞細(xì)胞組分、細(xì)胞懸液、冰凍切片）加樣（放射配基、緩沖液、標(biāo)本、非標(biāo)記配基）孵育（反應(yīng)達(dá)平衡）分離結(jié)合和游離的放射配基測(cè)量結(jié)合部分的放射性數(shù)據(jù)處理或觀察切片上的受體分布312023/3/30放射配基的要求高比活度：受體數(shù)量低高親和力：易達(dá)飽和、易分離高特異性：減少交叉反應(yīng)高放射化學(xué)純度：參數(shù)計(jì)算依據(jù)配基用量和比活度，大于95%結(jié)合與游離部分分離低溫和快速分離。過濾、離心、透析、電泳等常用過濾法:玻璃纖維濾膜322023/3/30總結(jié)

反應(yīng)類型結(jié)合類型標(biāo)記物待測(cè)物RIA免疫反應(yīng)競爭結(jié)合抗原抗原IRMA免疫反應(yīng)非競爭抗體抗原RBA受體配體非競爭配基受體數(shù)量和性質(zhì)332023/3/30非放射性標(biāo)記免疫分析提高靈敏度減少放射性廢物原理相同探測(cè)信號(hào)不同探測(cè)儀器不同342023/3/30

一、酶標(biāo)記免疫分析

(enzymeimmunoassay,EIA)EIA和

IEMA（酶免疫分析法）的測(cè)定原理與RIA和IRMA相同，競爭結(jié)合和非競爭結(jié)合。IEMA應(yīng)用最多-酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)。只是用酶替代標(biāo)記抗原或抗體的放射性核素常用的酶辣根過氧化酶(HRP),底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)分光光度計(jì)檢測(cè)352023/3/30二、化學(xué)發(fā)光免疫分析

化學(xué)發(fā)光免疫分析（ChemiluminescenceImmunoassayCLIA）

標(biāo)記物為能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的化合物，如異魯米娜、甲基氮蒽。堿性條件下遇過氧化物有單光子發(fā)射。缺點(diǎn):發(fā)光時(shí)間短?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析(ECLEA)

標(biāo)記物堿性磷酸酶，底物金剛烷?？煽啃愿?。電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)

電解反應(yīng)與化學(xué)發(fā)光結(jié)合。標(biāo)記物三丙胺，底物三價(jià)釕化合物?？裳h(huán)利用、發(fā)光時(shí)間長、強(qiáng)度高易測(cè)定等。362023/3/30二、熒光標(biāo)記免疫分析以熒光物質(zhì)標(biāo)記