實(shí)驗(yàn)微生物大小及數(shù)量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)微生物大小及數(shù)量測(cè)定第1頁/共21頁CentralLaboratoryofBiology實(shí)驗(yàn)五微生物大小及數(shù)量測(cè)定微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)第2頁/共21頁課前提問與目的要求【課前提問】1.顯微測(cè)微尺測(cè)量微生物大小的原理是什么？2.測(cè)定過程中應(yīng)注意哪些問題？【目的要求】1.學(xué)習(xí)并掌握使用顯微測(cè)微尺測(cè)定微生物大小的方法。2.掌握對(duì)不同形態(tài)細(xì)菌細(xì)胞大小測(cè)定的分類學(xué)基本要求，增強(qiáng)對(duì)微生物細(xì)胞大小的感性認(rèn)識(shí)。第3頁/共21頁【基本原理】微生物細(xì)胞的大小是微生物的形態(tài)特征之一，也是分類鑒定的依據(jù)之一。其測(cè)量工具有目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。鏡臺(tái)測(cè)微尺是中央部分刻標(biāo)準(zhǔn)刻尺的載玻片，其尺度總長(zhǎng)為1mm，精確分為10個(gè)大格，每個(gè)大格又分為10個(gè)小格，共100小格，每一小格長(zhǎng)度為0.01mm，即10μm。圖5-1鏡臺(tái)測(cè)微尺中央部分及鏡臺(tái)測(cè)微尺校正目鏡測(cè)微尺第4頁/共21頁目鏡測(cè)微尺是一塊可放入接目鏡內(nèi)的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，一般有等分為50小格和100小格兩種。測(cè)量時(shí)，需將其放在接目鏡中的隔板上，用以測(cè)量經(jīng)顯微放大后的細(xì)胞物象。由于不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數(shù)不同，目鏡測(cè)微尺每小格在不同條件下所代表的實(shí)際長(zhǎng)度也不一樣?！净驹怼康?頁/共21頁【實(shí)驗(yàn)用品】1.菌種：金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和迂回螺菌的染色玻片標(biāo)本。2.試劑：香柏油，二甲苯。3.儀器和其他用品：鏡臺(tái)測(cè)微尺，目鏡測(cè)微尺，普通光學(xué)顯微鏡，擦鏡紙等。第6頁/共21頁【方法步驟】目鏡測(cè)微尺的安裝校正目鏡測(cè)微尺菌體大小的測(cè)定測(cè)定完畢第7頁/共21頁1）使用鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行校正時(shí)，若一時(shí)無法直接找到測(cè)微尺，可先對(duì)刻尺外的圓圈線進(jìn)行準(zhǔn)焦后再通過移動(dòng)標(biāo)本推進(jìn)器進(jìn)行尋找。2）細(xì)菌個(gè)體微小，在進(jìn)行細(xì)胞大小測(cè)定時(shí)一般應(yīng)盡量使用油鏡，以減少誤差。3）細(xì)菌在不同的生長(zhǎng)時(shí)期細(xì)胞大小有時(shí)會(huì)有較大變化，若需自己制樣進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞大小測(cè)定時(shí)，應(yīng)注意選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體細(xì)胞材料。獲得本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵第8頁/共21頁【注意事項(xiàng)】1.目鏡測(cè)微尺很輕、很薄，在取放時(shí)應(yīng)特別注意防止使其跌落而損壞。2.觀察時(shí)光線不宜過強(qiáng)，否則難以找到鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度；換高倍鏡和油鏡校正時(shí)，務(wù)必十分細(xì)心，防止接物鏡壓壞鏡臺(tái)測(cè)微尺和損壞鏡頭。第9頁/共21頁【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】1.結(jié)果1）將目鏡測(cè)微尺校正結(jié)果填入表5-1中表5-1目鏡測(cè)微尺校正結(jié)果物鏡物鏡倍數(shù)目鏡測(cè)微尺格數(shù)鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度/μm低倍鏡高倍鏡油鏡目鏡放大倍數(shù)：

第10頁/共21頁2）將各菌測(cè)定結(jié)果記錄填入表5-2中。12345678910平均值(μm)金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌迂回螺旋菌注：球菌用直徑（寬度）表示細(xì)胞大小，桿菌和螺菌用寬度×長(zhǎng)度表示細(xì)胞大小。表5-2金黃色葡萄球菌大小測(cè)定記錄【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】第11頁/共21頁3）用表5-3對(duì)各菌測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算和表述。細(xì)菌名稱目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度/μm寬長(zhǎng)目鏡測(cè)微尺平均格數(shù)寬度μm目鏡測(cè)微尺平均格數(shù)長(zhǎng)度μm菌體大小金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌迂回螺菌注：球菌用直徑（寬度）表示細(xì)胞大小，桿菌和螺菌用寬度×長(zhǎng)度表示細(xì)胞大小?！緦?shí)驗(yàn)報(bào)告】第12頁/共21頁2.思考題

1）為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺重新對(duì)目鏡測(cè)微尺進(jìn)行校正？

2）在不改變目鏡和目鏡測(cè)微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來測(cè)定同一細(xì)菌的大小時(shí)，其測(cè)定結(jié)果是否相同？為什么？【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】第13頁/共21頁第二部分顯微鏡直接計(jì)數(shù)法測(cè)定微生物數(shù)量【課前提問】1.血球計(jì)數(shù)板的基本原理是什么？2.顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？【目的要求】1.明確顯微鏡計(jì)數(shù)的原理；2.學(xué)習(xí)使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。第14頁/共21頁【基本原理】血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由4條槽構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間較寬的平臺(tái)又被一段橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分9個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16小方格（圖5-2）；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm，則每一個(gè)大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3（10-4mL）。

第15頁/共21頁以25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板為例，設(shè)5個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，則：×25×104×B1mL菌液中的總菌數(shù)=

圖5-2血球計(jì)數(shù)板側(cè)面及兩種類型的計(jì)數(shù)室【基本原理】第16頁/共21頁圖5-2血球計(jì)數(shù)板第17頁/共21頁【實(shí)驗(yàn)用品】菌種：酵母菌懸液。儀器及其他：普通光學(xué)顯微鏡，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，蓋玻片，擦鏡紙，酒精燈，無菌毛細(xì)管，三角燒瓶?！痉椒ú襟E】菌懸液制備檢查血球計(jì)數(shù)板加樣品顯微鏡計(jì)數(shù)清洗第18頁/共21頁獲得本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵1）活細(xì)胞是透明的，因此在進(jìn)行顯微計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)適當(dāng)減低視野亮度，以增大反差。2）進(jìn)行顯微計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)先在低倍鏡下尋找大方格的位置，找到計(jì)數(shù)室后將其移至視野中央，再換高倍鏡觀察和計(jì)數(shù)。【注意事項(xiàng)】1）使用酒精燈時(shí)注意不要被火焰灼傷或燒到衣物。2）取放過微生物培養(yǎng)物的接種環(huán)在放回試驗(yàn)臺(tái)前應(yīng)記得再次在火焰上灼燒滅菌，以免造成實(shí)驗(yàn)臺(tái)污染。3）用接種環(huán)在培養(yǎng)基斜面上刮取時(shí)動(dòng)作要輕，不要將瓊脂培養(yǎng)基一起刮起。第19頁/共21頁【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】1.結(jié)果：表5-4顯微計(jì)數(shù)結(jié)果各中格中菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/mL12345第一