四液相色譜柱子使用及保養(yǎng)-0702

液相色譜實(shí)用技術(shù)

色譜柱的使用和保養(yǎng)色譜柱的選擇非極性或極性較小的樣品可用一般的C18柱酸堿性的化合物建議選用填料經(jīng)封尾鈍化過(guò)的C18柱，PH范圍2-9（12）糖類，氨基酸，有機(jī)酸，多環(huán)芳烴，GPC有專用柱鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上作為固定相。這種固定相要占所有柱填料的60-70%優(yōu)點(diǎn)∶固定相穩(wěn)定，不易流失應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑消除硅羥基的不良影響缺點(diǎn)∶pH值不能小于2或大于8同樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相同良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣拿到一根新色譜柱時(shí)，先測(cè)柱效保留在新色譜柱上測(cè)得的色譜圖，并記錄條件定期檢測(cè)柱效色譜柱的使用及操作流動(dòng)相的轉(zhuǎn)換特別是GPC柱流速(壓力)的變化幅度溫度的變化幅度專用色譜柱∶樣品及溶劑的要求色譜柱的保養(yǎng)（一）樣品方面除去微粒及雜質(zhì)了解樣品在流動(dòng)相中的溶解度如樣品的溶劑不是流動(dòng)相，一定要用流動(dòng)相試溶解度，防止其在流動(dòng)相中析出了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用為什么溶劑和樣品要過(guò)濾?

溶劑和樣品過(guò)濾非常重要，它會(huì)對(duì)色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對(duì)分析結(jié)果的影響。色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。樣品過(guò)濾頭的類型：30mm內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過(guò)濾，由0.2μm和0.45μm兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50μl。13mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過(guò)濾，由0.2μm和0.45μm兩種規(guī)格,材料為纖維素。3mm內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過(guò)濾，由0.2μm和0.45μm兩種規(guī)格。處理樣品體積為7μl。色譜柱的保養(yǎng)（二）流動(dòng)相方面除去微粒純度的要求超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低（建議走空白檢驗(yàn)）緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量注意溶劑的相容性，避免使用不相容的溶劑

流動(dòng)相對(duì)樣品的溶解度有機(jī)溶劑或水的比例溶劑過(guò)濾-除去微粒

不干凈的溶劑或在溶劑瓶中長(zhǎng)菌的溶劑會(huì)阻塞溶劑過(guò)濾器以及色譜柱。遵從下列建議可以提高性能，延長(zhǎng)溶劑過(guò)濾器和色譜柱的壽命：使用無(wú)菌溶劑瓶避免溶劑長(zhǎng)菌。用濾膜過(guò)濾溶劑去除微生物。每?jī)商旄鼡Q或過(guò)濾溶劑。避免溶劑瓶直接日照。向溶劑中加入0.0001-0.001M的疊氮化鈉。

選擇合適的濾膜

聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無(wú)任何可溶物。醋酸纖維濾膜：適用于水基溶劑，不適用于有機(jī)溶劑，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)的樣品。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸、70%乙醇、二氯甲烷、不適用于DMF二甲基甲酰胺再生纖維素濾膜：具有蛋白質(zhì)吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑。注意：1）每張濾膜只能用一次。2）水相和有機(jī)相不要搞混。溶劑的相溶性

溶劑信息

避免使用下列對(duì)不銹鋼有腐蝕性的溶劑：鹵化物堿金屬溶液和相應(yīng)的酸溶液。高濃度的無(wú)機(jī)酸例如：硝酸和硫酸。能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物。含有過(guò)氧化物的色譜級(jí)醚必須用氧化鋁干燥劑。在有機(jī)溶劑中的有機(jī)酸溶液。含有強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液。四氯化碳和異丙醇或THF混合液。溶劑準(zhǔn)備：脫氣流動(dòng)相使用前為什么要脫氣？

流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理

，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過(guò)程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無(wú)法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會(huì)造成熒光猝滅。常用的脫氣方法比較：

氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。在線真空脫氣法：LC真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)，

在線脫氣，智能控制，無(wú)需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。

流動(dòng)相的保存有機(jī)溶劑流動(dòng)相:室溫下密封,避光保存緩沖鹽流動(dòng)相:當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用低溫下密封保存,一般不超過(guò)3天防止長(zhǎng)菌有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動(dòng)相:低溫密封保存防止有機(jī)相的揮發(fā)選用適宜的容器2星期1天1星期1小時(shí)新鮮配制5101520250分保存于聚乙烯瓶中的超純水測(cè)試條件水樣:40mltraceenrichment@2.0ml/min色譜柱:C18反相柱(Waters)梯度:線性100%水－100%乙腈波長(zhǎng):254nm1天1星期新鮮配制5101520250分保存于標(biāo)準(zhǔn)棕色玻璃瓶中的超純水測(cè)試條件水樣:40mltraceenrichment@2.0ml/min色譜柱:C18反相柱(Waters)梯度:線性100%水－100%乙腈波長(zhǎng):254nm色譜柱保護(hù)

在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)除去樣品及流動(dòng)相中的顆粒給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù)防止分析柱被化學(xué)污染裝置在線過(guò)濾器自裝填料保護(hù)柱預(yù)裝保護(hù)柱柱壓過(guò)高為什么柱壓會(huì)過(guò)高微粒堵塞樣品流動(dòng)相密封墊柱床膨脹不可逆吸附細(xì)菌生長(zhǎng)柱效低為什么柱效低色譜柱被污染過(guò)濾片部分堵塞樣品、流動(dòng)相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞色譜柱內(nèi)的死體積流動(dòng)相pH值及組成不合適造成固定相流失流速急劇變化造成固定相物理?yè)p壞機(jī)械震動(dòng)造成固定相產(chǎn)生裂縫柱床收縮或干枯重復(fù)性差、回收率低實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差色譜柱被污染流動(dòng)相pH值及組成不合適造成鍵合相流失樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相過(guò)強(qiáng)或流動(dòng)相過(guò)弱非特異性吸附色譜柱的日常清洗對(duì)所做的樣品要有充分的了解用對(duì)該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動(dòng)相清洗（如反相C18柱用100%甲醇或乙腈）硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)，再用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗

柱子尺寸柱子體積沖洗體積150x4.6mm2.5ml50ml200x4.6mm3.3ml65ml250x4.6mm4.2ml80ml**再有雜質(zhì)嚴(yán)格清洗：20倍柱體積的水-相同體積的0.05mol/L硫酸，最后用流動(dòng)相清洗色譜柱的清洗-物理阻塞在安裝柱前后測(cè)試壓力差如果柱壓力太高，反裝色譜柱，并用10-20倍柱體積的流動(dòng)相沖洗色譜柱，監(jiān)測(cè)壓力變化若出現(xiàn)沉淀

(如：蛋白凝聚、細(xì)胞物、聚合物)設(shè)法用相應(yīng)的可溶性溶劑，如

0.1%TFA/80%乙腈,6M鹽酸胍,THF,HFIP若仍無(wú)效，應(yīng)考慮更換過(guò)濾片色譜柱頭塌陷的修補(bǔ)

柱頭有塌陷可用填料修補(bǔ)：1）松開(kāi)柱入口接頭，拆下不銹鋼燒結(jié)過(guò)濾器，常見(jiàn)柱頭塌陷，剔掉無(wú)規(guī)則床層和帶色填料，使柱床呈白色水平面，滴一滴甲醇，加少許填料使沉降，如此反復(fù)多次后，用刮刀將填料刮平，放上清洗過(guò)的不銹鋼燒結(jié)過(guò)濾器，裝上柱入口接頭，把柱重新接到LC儀器上慢慢地增加流速，直到操作上限為止。2）如果柱頭塌陷較深（小于1cm）可逐漸減低流速至零，再次拆下柱子，用填料修補(bǔ)直到塌陷填滿為止。色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、鹽等，防止細(xì)菌生長(zhǎng)合適的存放溶劑兩端密封保存，避免色譜柱床干枯避免機(jī)械震動(dòng)注意存放的溫度色譜柱以外的因素（一）“柱效”問(wèn)題，不一定是色譜柱問(wèn)題！儀器問(wèn)題：連接不好造成死體積進(jìn)樣器檢測(cè)器管路，連接口保護(hù)柱在線過(guò)濾器堵塞流動(dòng)相問(wèn)題：色譜柱未平衡好進(jìn)樣量太大色譜柱與儀器的聯(lián)接不同公司產(chǎn)品，其接頭不同。處理不當(dāng)時(shí)，會(huì)造成：色譜峰展寬（死體積）使柱效下降、或滲漏解決辦法：使用“通用”型接頭（錐箍及螺母）這種錐箍在不銹鋼管上是活動(dòng)的，因此可以換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。PEEK工程塑料的接頭，可用在所有類型的色譜柱上的。色譜柱以外的因素（二）柱壓過(guò)高問(wèn)題，不一定是色譜