深圳大學(xué)理科選修《遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)》課件7重組DNA

重組DNA大腸埃希菌俗名大腸桿菌是人和動物腸道中最主要的細(xì)菌之一是正常菌群的成員出生后數(shù)小時就進(jìn)入腸道，并伴隨終生能合成維生素B和K，供人體利用能抑制腐敗菌及病原菌（如金黃色葡萄球菌、志賀菌屬）真菌（如白念珠菌）的過度增殖異位寄居時可引起腸外感染某些菌株有致病性—消化道感染，導(dǎo)致腹瀉等每個人每天平均從糞便中排出1011到1013個可作為糞便污染的檢測指標(biāo)常作為細(xì)菌的模式生物廣泛用于科學(xué)研究基因工程的工具菌衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢查大腸菌群指37OC24h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣包括埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬及腸桿菌屬等大腸菌群指數(shù)指1000ml被檢樣品中的大腸菌群數(shù)生活飲用水的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)coli-index≤3個我國2007年開始實施的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定每100ml生活飲用水中，不得檢出總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希菌

1、細(xì)菌培養(yǎng)--平板培養(yǎng)劃線法培養(yǎng)涂布法培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)限制性內(nèi)切酶EcoRI內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶:一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。分子剪刀限制—修飾現(xiàn)象Kλ（B）λ（B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長的λ噬菌體第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生長受寄主限制Kλ（K）存活下來的噬菌體再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制EOP:Efficiencyofplating（生長在不同寄主中的λ噬菌體的成斑率，表示限制程度）說明K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)可排除外來的DNA；10-4的存活率是由宿主限制系統(tǒng)作用的結(jié)果產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因何在甲基化酶：能使細(xì)胞自身核酸的內(nèi)切酶識別序列的堿基甲基化，從而使自身核酸免受內(nèi)切酶水解——細(xì)菌的“防御”系統(tǒng)核酸內(nèi)切酶：識別并水解外源DNA（外來核酸在內(nèi)切酶識別序列上沒有甲基化修飾作保護(hù)）研究發(fā)現(xiàn)：原來是由兩種酶配合完成，一種是起修飾作用的甲基化酶，另一種是核酸內(nèi)切酶限制修飾在限制修飾系統(tǒng)中，限制作用是指一定類型的細(xì)菌可以通過限制性酶的作用，破壞入侵的外源DNA（如噬菌體DNA等），使得外源DNA對生物細(xì)胞的入侵受到限制；

而宿主細(xì)胞自身的DNA分子合成后，通過修飾酶的作用：在堿基中特定的位置上發(fā)生了甲基化而得到了修飾，可免遭自身限制性酶的破壞，這就是限制修飾系統(tǒng)中修飾作用的含義。限制—修飾體系，其功能就是保護(hù)自身的DNA，分解外來的DNA，以保護(hù)和維持自身遺傳信息的穩(wěn)定，這對細(xì)菌的生存和繁衍具有重要意義。分類核酸外切酶核酸內(nèi)切酶核酸酶從核酸鏈的一端開始，一個接一個地消化降解核苷酸從核酸鏈分子內(nèi)部切割3’，5’磷酸二酯鍵，使之?dāng)嗔研纬尚∑魏怂醿?nèi)切酶：按限制性酶的組成、限制和修飾活性、切斷核酸的情況不同，分三類（I，II，III），通常指的是II型。

命名法HindIII同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶如從流感嗜血桿菌d菌株（Haemophilusinfluenzaed）先后發(fā)現(xiàn)3種限制性酶，則分別命名為HindI，HindII，HindIII大腸桿菌R菌株REscherichia嗜血流感桿菌d株dinfflluenzaeHaemophiillus株名（型號）種名的頭兩個字母宿主屬名的第一個字母coli前3個字母代表來源的生物隨后1個字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株最后1個羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序

質(zhì)粒質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1~200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性等。萊德伯格（1925~2008），美國遺傳學(xué)家。細(xì)菌遺傳學(xué)的創(chuàng)始人之一。1925年5月23日生于美國蒙特克萊市。1944年獲哥倫比亞大學(xué)學(xué)士學(xué)位，以后曾在醫(yī)學(xué)院學(xué)習(xí)，不久轉(zhuǎn)入耶魯大學(xué)，于1947年獲博士學(xué)位。1959年起任斯坦福醫(yī)學(xué)院教授兼遺傳學(xué)系主任。1962年任肯尼迪分子醫(yī)學(xué)實驗室主任。他在耶魯大學(xué)期間，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的遺傳重組。1946年，他和E.L.塔特姆發(fā)現(xiàn)遺傳重組的普遍性。1952年發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的F因子。1952年發(fā)現(xiàn)沙門氏菌中的普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)，1953年發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的溫和噬菌體λ在染色體上占有一定位置。1956年發(fā)現(xiàn)λ噬菌體能進(jìn)行局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。他們的研究工作還包括應(yīng)用細(xì)菌的有性生殖和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行細(xì)菌的免疫學(xué)和代謝作用等方面的研究。

1958年他和G.W.比德爾和E.L.塔特姆共同獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)接合：指通過細(xì)菌細(xì)胞的直接接觸，遺傳物質(zhì)從供體轉(zhuǎn)移到受體并發(fā)生重組的過程。1946年萊德伯格和塔特姆發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的接合。這種野生型細(xì)胞如何出現(xiàn)的？U型管實驗：A、B菌株分別培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基上一邊加壓和吸引使培養(yǎng)液充分混合結(jié)果任何一臂的培養(yǎng)基上均未長出野生型細(xì)菌。結(jié)論：菌株A與菌株B細(xì)胞直接接觸（接合）是野生型細(xì)胞出現(xiàn)的必要條件；兩菌株直接接觸后導(dǎo)致遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而發(fā)生基因重組，產(chǎn)生野生型細(xì)菌。試驗證明：接合過程是一種單向轉(zhuǎn)移，A菌株遺傳物質(zhì)

B菌株，從供體到受體。用大腸桿菌K12的菌株A和菌株B，首先用高劑量的鏈霉素處理菌株A或菌株B，把處理過的菌株A跟未處理過的菌株B混合，或把處理過的菌株B跟未處理過的菌株A混合，發(fā)現(xiàn)結(jié)果大不相同：⑴F因子：致育因子或稱性因子，是一種附加體。攜帶F因子的菌株稱為供體菌或雄性，用F＋表示。未攜帶F因子的菌株為受體菌或雌性，用F－表示。F因子及F＋向F－的轉(zhuǎn)移⑵F因子的結(jié)構(gòu)染色體外遺傳物質(zhì)（質(zhì)粒），環(huán)狀DNA，9×104bp，大約為大腸桿菌環(huán)狀染色體的2%，具有40~60個蛋白質(zhì)基因。每個細(xì)胞（F＋）有2~4個。⑶F因子的三種狀態(tài)②有一個自主狀態(tài)的F因子，即F＋細(xì)胞；

③帶有一個整合的F因子的細(xì)胞叫高頻重組細(xì)胞，Hfr細(xì)胞。①沒有F因子，即F－細(xì)胞；

F＋與F－菌（1）有F因子的細(xì)菌稱為F＋，細(xì)菌增殖時可把F

因子傳遞給后代細(xì)胞（通過自主復(fù)制）。（2）沒有F因子的細(xì)菌稱為F－，F(xiàn)＋細(xì)菌經(jīng)吖啶橙處理而丟失，成為F－。F因子一經(jīng)丟失，細(xì)胞中便不再出現(xiàn)；（3）F＋可以和F－雜交，而不能和F＋雜交；（4）F＋菌與F－菌混合（即F＋×F－）1小時后，約95%的F－菌轉(zhuǎn)變?yōu)镕＋菌，而原來的F＋仍然保留有F因子。分子克隆pUC18pUC19含四個部分：（1）來自pBR322的質(zhì)粒復(fù)制起點（ori）；（2）ampr;（3）大腸桿菌β半乳糖苷酶基因（lacZ’）的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列；（4）多克隆位點（MCS）lacZ`OriAmprMCS藍(lán)白斑篩選重組子的原理：

lacZ’編碼β半乳糖苷酶的α肽，在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)下，使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）被分解產(chǎn)生藍(lán)色。因此攜帶空載體的大腸桿菌呈藍(lán)色菌落。外源基因的插入使α肽失活，因而攜帶外源基因的重組子菌落呈白色。利用菌落顏色篩選重組子PUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點：基因組小，拷貝數(shù)高，DNA產(chǎn)量高；有LacZ篩選標(biāo)記，LacZ基因插入失活，可用藍(lán)白斑篩選陽性克隆；有MCS，其中有13個以上的單一限制位點，可用于外源基因克隆。意義與應(yīng)用

重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用開辟了分子遺傳學(xué)研究的新領(lǐng)域，打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創(chuàng)造新物種的大門。它的成就對于工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，并將為解決世界面臨的能源、食品和環(huán)保三大