Westernblot詳解及問題分析課件

蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及常見問題分析WesternBlot簡介WesternBlot一般流程WesternBlot常見問題分析WesternBlot簡介：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。WesternBlot優(yōu)點(diǎn)

高分辨率的電泳技術(shù)特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)1-5ng中等大小的靶蛋白WesternBlot應(yīng)用目的蛋白的表達(dá)特性分析目的蛋白與其它蛋白的互作目的蛋白的組織定位目的蛋白的表達(dá)量分析WesternBlot流程蛋白樣品的制備SDS轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色蛋白樣品的定量目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）、Lowry法（Folin-酚試劑法）、BCA法等。但各有優(yōu)缺點(diǎn)，大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測(cè)定樣品濃度。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的各種方法匯總：蛋白樣品的變性2×SDS上樣緩沖液：DTT可臨用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分裝，-20℃凍存。按1:1比例與蛋白質(zhì)樣品混合，95～100℃加熱5～15min，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為20-25μl，總蛋白量20～50μg。1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚藍(lán)0.2g總體積100ml100mMTris-HCl(pH6.8)200mMDTT4%SDS0.2%溴酚蘭20%甘油ddH2OSDS：陰離子去污劑變性劑氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異。與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線性化。不連續(xù)的電泳緩沖體系。SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS

是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基的相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)?！維DS基本原理】凝膠成分丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨Tris-甘氨酸電泳緩沖液聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：單體：丙烯酰胺（Acr）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；催化劑：過硫酸胺或核黃素（AP）；加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過提供氧游離基(freeradicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redoxsystems)來完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（AP—TEMED）和光化學(xué)催化（核黃素——TMTED）體系。凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS濃縮膠(5%Acrylamide)及分離膠配方表：

不連續(xù)電泳：

作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠使蛋白樣品濃縮pH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小電泳緩沖液：pH8.3Tris-甘氨酸系統(tǒng)。灌制積層膠插入梳子StakinggelSeparatinggel轉(zhuǎn)膜要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜）上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場(chǎng)的機(jī)械裝置不同。濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4℃過夜?；厥找豢谷芤海肨BST漂洗膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4℃過夜?；厥找豢谷芤海肨BST漂洗膜3次，每次10min。最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)膜解吸方法（膜的重復(fù)利用）

通過加熱和去污劑進(jìn)行解吸

原理：組合使用去污劑和加熱使抗體解離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。酸解吸

原理：使用低pH改變抗體結(jié)構(gòu)從而使結(jié)合位點(diǎn)失活，從而將抗體與抗原分離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。WesternBlot結(jié)果分析目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。WesternBlot結(jié)果分析軟件Gel-ProAnalyzer4綠色版（附動(dòng)畫演示教程）

WesternBlot常見問題分析SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入AP和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對(duì)齊條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動(dòng)作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適SDS電泳轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè)凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白很少蛋白分子量<

10KD蛋白的等電點(diǎn)<9SDS濃度不合適凝膠太厚

原因?qū)Σ叩鞍追肿恿?lt;10KD時(shí)，減少轉(zhuǎn)膜時(shí)間；使用小孔徑的膜更換高pH值Buffer在陰極buffer中加入0.005-0.01%SDS可提高轉(zhuǎn)膜效率延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過高

原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度背景太高雜交信號(hào)很弱抗體保存不當(dāng)抗原不充足膜的漂洗過度

原因?qū)Σ呖贵w長期保存應(yīng)在－70℃，使用前做效價(jià)檢測(cè)增加蛋白上樣量，做已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對(duì)照減少漂洗的時(shí)間和次數(shù)一抗不是唯一特異的二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合

原因?qū)?/p>