乳酸菌增菌培養(yǎng)基的營養(yǎng)因子優(yōu)化

PAGEPAGEII乳酸菌增菌培養(yǎng)基的營養(yǎng)因子優(yōu)化學(xué)生姓名：學(xué)號：指導(dǎo)教師：所在學(xué)院：食品學(xué)院專業(yè)：食品質(zhì)量與安全中國·大慶PAGEI摘要以改良MRS發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),選擇玉米漿、牛肉膏、乳糖、番茄汁、胰蛋白胨等7個營養(yǎng)因子增菌培養(yǎng)乳酸菌進行優(yōu)化。利用L8(27)正交實驗,優(yōu)化出培養(yǎng)基營養(yǎng)因子最佳組成是:玉米漿3%、牛肉膏1%、乳糖1%。研究結(jié)果表明,嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳酸菌,在優(yōu)化后的MRS培養(yǎng)基發(fā)酵液中,37℃培養(yǎng)20h,菌落數(shù)均高于原MRS培養(yǎng)基發(fā)酵液的菌落數(shù),達到109cfu/mL以上,乳酸菌發(fā)酵液得到了濃縮,大大降低了乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基的成本,原料成本降低了約40%。關(guān)鍵詞：乳酸菌,營養(yǎng)因子,優(yōu)化培養(yǎng)AbstractEthanolwasusedforextractingblackricepigmentunderultrasoundassistance.Tomaximizetheextractionofblackricepigment,orthogonalarraydesignwasemployedforinvestigatingtheeffectsofethanolconcentration,solid-to-liquidratio,ultrasoundpower,extractiontimeonblackricepigmentyield(representedbytheabsorbanceat543nmwavelengthofextractsolution).Resultsshowedthattheuseof80%ethanolforextractingblackricegrainsat1:40solid-to-liquidratio(g/mL)withtheassistanceof30minultrasoundtreatmentat350Wgaveanoptimalpigmentextractionandtheresultingpigmentyieldreachedupto2.07%.Keywords:blackrice；pigment；orthogonalarraydesign；ultrasound-assistedextraction目錄1前言 11.1課題來源 11.2課題研究的目的及意義 11.2.1黑米中色素的應(yīng)用 21.3研究現(xiàn)狀 31.4前景展望 32實驗設(shè)計與方法 32.1實驗材料 32.2主要設(shè)備 32.3試驗過程與方法 32.3.1工藝流程 32.4浸提條件的選擇 42.4.1乙醇濃度對黑米黑色素提取效果的影響 42.4.2超聲浸提時間的選擇對黑米黑色素提取效果的影響 42.4.3超聲功率對黑米黑色素提取效果的影響 42.4.4料液比對黑米皮色素提取效果的影響 42.4.5最佳工藝條件的選擇 43結(jié)果與分析 53.1影響黑米皮色素提取效果的單因素研究 53.1.1乙醇濃度對黑米皮色素提取效果的影響 53.1.2超聲浸提時間的選擇對黑米黑色素提取效果的影響 53.1.3超聲功率對黑米皮色素提取效果的影響 63.1.4料液比對黑米皮色素提取效果的影響 63.2多因素試驗 63.2.1正交試驗 64.結(jié)論 7致謝 9PAGE31前言乳酸菌是有益于人體健康的益生菌,主要存在于人體腸道,其有助于宿主調(diào)整正常菌群,維持腸道微生態(tài)環(huán)境的平衡。乳酸菌的代謝產(chǎn)物能降低腸道內(nèi)的pH值,抑制腸道中腐敗菌的生長和減弱腐敗菌在腸道的產(chǎn)毒作用,并有幫助消化、防止便秘,防止細(xì)胞老化,降低膽固醇,抗腫瘤以及調(diào)節(jié)人體生理機能等保健和醫(yī)療作用[1-5]。本文以提供乳酸菌生長的MRS培養(yǎng)基為研究素材，通過單因素實驗了解各種營養(yǎng)因子對乳酸菌生長的影響，利用正交實驗對原MRS培養(yǎng)基進行了優(yōu)化及選擇廉價的原料為營養(yǎng)添加劑,旨在選出適合的最佳營養(yǎng)因子組成。1.1課題來源本課題來源于院內(nèi)自選課題1.2乳酸菌培養(yǎng)基簡介俗乳酸菌工業(yè)產(chǎn)品為菌體本身細(xì)胞，因而設(shè)計出能增菌的培養(yǎng)基在工業(yè)上具有重要意義。設(shè)計選用工業(yè)上佳美低廉的原料，便于降低成本，也有利于降低菌種的適應(yīng)期，利于增值。乳酸菌增菌液配方設(shè)計中因營養(yǎng)要求復(fù)雜,影響生長的因素多,在實際工作中還應(yīng)做其他條件的優(yōu)化,如增菌液氧化還原電勢、pH值、溫度等,因工作量大而時間有限,只能對配方作初步的優(yōu)化設(shè)計。為了降低生產(chǎn)成本,在工業(yè)應(yīng)用時可選用乳清和脫脂乳經(jīng)蛋白酶水解,用以提高增菌效果,再加入乳糖、啤酒酵母的自溶水解物,在發(fā)酵罐內(nèi)完成乳酸菌的增菌,罐內(nèi)可以通入過濾除菌的N2和CO2,以降低反應(yīng)液氧化還原電勢(特別是保加利亞乳桿菌)。若有自動化發(fā)酵罐還可通過監(jiān)測pH值,發(fā)酵罐自動注入滅菌的1mol-1NaOH或NH4OH液,以中和代謝乳酸。培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植物和動物組織生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。有的培養(yǎng)基還含有抗菌素和色素，用于單種微生物培養(yǎng)和鑒定。培養(yǎng)基由于配制的原料不同，使用要求不同，而貯存保管方面也稍有不同。一般培養(yǎng)基在受熱、吸潮后，易被細(xì)菌污染或分解變質(zhì)，因此一般培養(yǎng)基必須防潮、避光、陰涼處保存。對一些需嚴(yán)格滅菌的培養(yǎng)基（如組織培養(yǎng)基），較長時間的貯存，必須放在2~6℃的冰箱內(nèi)。由于液體培養(yǎng)基不易長期保管，現(xiàn)在均改制成粉末?；瘜W(xué)分類：天然培養(yǎng)基（指一類利用動、植物或微生物體包括其提取物制成的培養(yǎng)基。如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等）；組合培養(yǎng)基（又稱為合成培養(yǎng)基或綜合培養(yǎng)基，是一類按微生物的營養(yǎng)要求精確設(shè)計后用多種高純化學(xué)試劑配制成的培養(yǎng)基。如葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基、淀粉硝酸鹽培養(yǎng)基等。）；半組合培養(yǎng)基（指一類主要以化學(xué)試劑配制，同時還加有某種或某些天然成分的培養(yǎng)基。例如，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。）物理分類：液體培養(yǎng)基（一類呈液態(tài)的培養(yǎng)基。）；固體培養(yǎng)基（一類外觀呈固態(tài)的培養(yǎng)基。根據(jù)性質(zhì)又分為固化培養(yǎng)基、非可逆性固化培養(yǎng)基、天然固態(tài)培養(yǎng)基、濾膜。）；半固體培養(yǎng)基（指在液體培養(yǎng)基中加入少量的凝固劑而配制成的半固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。）；脫水培養(yǎng)基（又稱預(yù)制干燥培養(yǎng)基，指含有除水分外的一切成分的商品培養(yǎng)基。)微生物分類：選擇性培養(yǎng)基（一類根據(jù)某微生物的特殊營養(yǎng)要求或其對某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基，具有使混合菌樣中的劣勢菌變成優(yōu)勢菌的功能，廣泛用于菌種篩選等領(lǐng)域。）；鑒別培養(yǎng)基（一類在成分中加有能與目的菌的無色代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而達到只須用肉眼辨別顏色就能方便的從近似菌落中找出目的菌菌落的培養(yǎng)基。例如，伊紅美藍乳糖培養(yǎng)基（EMB）。）另外一種就是天然培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進細(xì)胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也是必不可少。1.2.1存在的問題目前的培養(yǎng)基雖能進行乳酸菌生產(chǎn)，但是，其有操作復(fù)雜、產(chǎn)量小、資源浪費、成本過高等不足之處。1.2.2培養(yǎng)基優(yōu)化的重要意義合理配置的培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物質(zhì)成分達到最適比例，PH達到最適，溶解氧也達到了最適濃度，這樣就給微生物創(chuàng)造了最適宜生長的環(huán)境條件，并且對環(huán)境產(chǎn)生的污染降到最低，實現(xiàn)了資源的循環(huán)利用。又能單位時間內(nèi)生長最多的菌量。同時減少了動力設(shè)備與加壓設(shè)備，大大減少了成本，這對于一個生產(chǎn)企業(yè)來說無疑意義重大。1.3研究現(xiàn)狀食品加工行業(yè)應(yīng)充分利用、開發(fā)、加工現(xiàn)有黑米黑色素，使之應(yīng)用于食品中成為廣大城鄉(xiāng)人民樂于消費的食品。醫(yī)療保健營養(yǎng)研究部門應(yīng)對黑米黑色素的特殊藥用保健功能作更深入的研究，進一步揭示我國黑米對人體健康的作用機理。隨著人民購買力的提高，將從單一糧食轉(zhuǎn)向多樣化的優(yōu)質(zhì)食品來改進膳食結(jié)構(gòu)，而既具營養(yǎng),又有保健功能的食品將是人們所關(guān)注和喜愛的食品。特別是隨著我國逐步進入老齡社會，老齡食物應(yīng)重點發(fā)展抗衰老食品。因此在今后一段時期內(nèi),在人類開發(fā)自然、回歸自然的浪潮中，作為人民生活的主要必需品之一的中國黑米也必將有著廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[20-21]。1.4前景展望目前國內(nèi)外植物天然色素的產(chǎn)品種類與產(chǎn)量甚少飛遠遠滿足不了食品飲料加工業(yè)的需求。為解決這一問題,各國都在積極致力于植物天然色素的研究與開發(fā)。黑米在品種中屬于名貴珍奇的特種類型,古為皇家專用貢品,世人譽稱“米中皇”,是高營養(yǎng)多功能滋補保健食品。黑米不僅含有比普通稻米豐富得多的蛋白質(zhì),氨基酸組成也相當(dāng)齊全高含種必需氨基酸,還含有多種微量已素特別是高含鐵、維生素等,而民在果皮中和部分品種的穎殼中含有大量天然黑紫色素是黑紫色素的重要來源[22]。因此,研究利用黑米開發(fā)天然黑紫色素,對食品、醫(yī)藥加工和化妝行業(yè)都具有重要意義。2實驗設(shè)計與方法2.1實驗材料實驗原料：黑米，檸檬酸、Na2HPO4、無水乙醇均為分析純。2.2主要設(shè)備SK8200HP超聲波清洗器南京昕航科學(xué)儀器有限公司；722N可見分光光度計杭州天釗科技有限公司；FA1604N電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵上海金鵬分析儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海青浦滬西儀器廠；SQ2119多功能食品加工機上海帥佳電子科技有限公司；ZK-82B型真空干燥箱型號西安唯信檢測設(shè)備有限公司。2.3試驗過程與方法2.3.1工藝流程黑米→洗凈烘干→粉碎→加入提取劑→超聲浸泡提取→過濾黑色澄清透明液體→減壓濃縮回收提取劑→真空干燥產(chǎn)物→計算提取率2.4浸提條件的選擇研究超聲波功率、乙醇濃度、料液比(黑米:乙醇溶液，m/V)及浸提時間對黑米黑色提取率的影響，首先做單因素試驗考察以上條件對提取率的影響，然后采用正交試驗法優(yōu)化最佳工藝條件。用分光光度計測定吸光度，作為色素提取率的標(biāo)準(zhǔn)。2.4.1乙醇濃度對黑米黑色素提取效果的影響準(zhǔn)確稱取2.5g粉碎的黑米，在常溫條件下，在超聲功率300W，料液比為1∶30，提取時間為30min，乙醇濃度分別為20%、40%、60%、80%、100%，研究其對黑色素提取率的影響，在波長543nm處測定吸光度作為指標(biāo)。2.4.2超聲浸提時間的選擇對黑米黑色素提取效果的影響準(zhǔn)確稱取2.50g粉碎的黑米，在常溫條件下，取80%的乙醇溶液作為浸提劑，料液比1:30，超聲波頻率300W，浸提時間分別為10、20、30、40、50、60min，研究不同超聲浸提時間對黑色素提取率的影響，在波長543nm處測量吸光度作為提取指標(biāo)。2.4.3超聲功率對黑米黑色素提取效果的影響準(zhǔn)確稱取2.50g粉碎的黑米，在常溫條件下，在乙醇濃度為80%，料液比為1∶30，提取時間為30min，超聲功率分別為150W、200W、250W、300W、350W，在波長543nm處測量吸光度作為提取指標(biāo)。2.4.4料液比對黑米皮色素提取效果的影響準(zhǔn)確稱取2.50g粉碎的黑米，在常溫條件下，在超聲功率300W，乙醇濃度80%，提取時間為30min，料液比分別為1:10、1:20、1:30、1:40、1:50，研究不同料液比對黑色素提取率的影響，在波長543nm處測量吸光度作為提取指標(biāo)。2.4.5最佳工藝條件的選擇在單因素試驗的基礎(chǔ)上，為了獲得以乙醇作為浸提劑，超聲波輔助提取黑米中黑色素的最佳工藝條件，利用正交法“均衡分散”和“整齊可比”的特點，以乙醇濃度、浸提時間、料液比、超聲波功率4個因素為考察因素，以浸取樣品中的黑色素提取率為主要考察目標(biāo)，采用L9(34)正交表進行正交試驗設(shè)計，以確定最佳提取條件，測定浸提液吸光度作為提取指標(biāo)。3結(jié)果與分析3.1影響黑米皮色素提取效果的單因素研究3.1.1乙醇濃度對黑米皮色素提取效果的影響圖1乙醇濃度對黑米皮色素提取效果由圖1可見，乙醇濃度對提取率的影響較大，濃度為80%的乙醇提取率最高，其次是60%，乙醇濃度較高或較低提取率都不佳。這主要是由于黑米黑色素是由苷元與糖基構(gòu)成，具有較強的極性，不同濃度的乙醇極性不同，根據(jù)“相似相溶”原理，乙醇濃度為80%時對黑米皮色素的溶解能力最強。3.1.2超聲浸提時間的選擇對黑米黑色素提取效果的影響圖2超聲浸提時間的選擇對黑米黑色素提取效果由圖2可見，隨著超聲浸提時間的延長，黑色素提取率隨之升高，但時間超過30min后，變化緩慢。因此選定浸提時間30、40、50min作為正交試驗的3個水平。3.1.3超聲功率對黑米皮色素提取效果的影響圖3超聲功率對黑米皮色素提取效果由圖3可見，隨著功率增加，黑米皮色素吸光度值逐漸升高，而后略有下降。超聲波功率小，不能使物料充分受到超聲波的作用，黑米皮色素提取不完全，但在超聲波功率高于350W后，變化趨勢不再明顯，甚至出現(xiàn)提取率下降，這主要是由于超聲波功率太大可能造成黑米皮色素降解，含量下降，因此選擇超聲波功率350W為最佳。3.1.4料液比對黑米皮色素提取效果的影響圖4料液比對黑米皮色素提取效果料液比的提高必然會在較大的程度上提高傳質(zhì)推動力。由圖4可以看出，隨著液固比的增大，提取率也隨之增大，當(dāng)液固比增大到一定值后，提取率的增加趨于平緩。同時液液比的增大也提高了生產(chǎn)成本及后續(xù)處理的難度，所以料液比不宜太高，因此選擇1：40比較合適。3.2多因素試驗3.2.1正交試驗根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取影響黑米黑色素提取效果各因素中有意義的水平做正交試驗，對結(jié)果進行極差分析，以確定最佳的提取條件。采用L9(34)正交表，以乙醇濃度A、超聲浸提時間B、超聲功率C、料液比D作為4個考察因素，選取3個水平進行試驗，其因素水平表見表1。按表1的正交因子水平設(shè)計L9(34)正交試驗，試驗結(jié)果及分析見表2。表1正交試驗因素與水平的設(shè)定因素/水平A乙醇濃度（%）B超聲浸提時間(min)C超聲功率(W)D料液比140302501：20260403001：30380503501：40表2黑米黑色素提取正交實驗的結(jié)果L9（34）因素乙醇濃度（%）浸提時間（min）超聲功率（W）料液比吸光度值111110.283212220.365313330.323423230.237521310.392622120.266732320.373833130.384931210.272K10.3240.5370.3110.316K20.3280.5170.3210.335K30.3430.5000.3630.345R0.0190.0370.0520.029從正交實驗表的試驗結(jié)果可知，影響黑米黑色素提取效果的主次順序是超聲功率(C)>超聲浸提時間(B)>料液比(D)>乙醇濃度(A)。因此得到的提取黑米皮色素的最佳條件A3B1C3D3，即乙醇濃度為80%，超聲浸提時間為30min，超聲功率為350W，料液比為1：40。3.2.2黑米中黑色素含量的測定稱取黑米2.000g，用最佳條件進行提取，將提取液濃縮、干燥，從而得到黑米中黑色素的粗品質(zhì)量，進行3次平行試驗。結(jié)果如下表3。表3黑米黑色素含量表序號123重量(g)2．52.52.5料液比（g/ml）1:401:401:40功率（W）350350350時間（min）303030乙醇濃度（%）808080黑色素粗質(zhì)量(g)0.0510.0490.046得率(%)2.41.961.84得率為：Y=W/G×100%=2.07%其中：Y-黑米黑色素的得率（%）；G-黑米的質(zhì)量（g）；W-為黑米中提取出來的黑色素的粗質(zhì)量（g）。3.2.3最佳工藝條件試驗按A3B1C3D3條件進行3次平行試驗，結(jié)果見表4所示。表4A3B1C3D3條件下的得率（%）試驗123平均值得率2.41.961.842.074.結(jié)論首先進行了單因素試驗，對影響超聲波法黑米黑色素得率的四個因素：液料比、乙醇濃度、超聲時間、超聲功率進行了研究。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，用正交試驗對黑米黑色素的提取工藝進行了優(yōu)化設(shè)計。正交試驗設(shè)計采用四因素三水平的正交表L9(34)，確定了超聲波法黑米黑色素提取的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度：80%，超聲浸提時間：60，超聲功率：128W，料液比：1:40（g∶mL）。此時，多糖得率達到2.07%，結(jié)果還表明，四個因素中超聲功率(C)>超聲浸提時間(B)>料液比(D)>乙醇濃度(A)。參考文獻[1]溫廣宇,朱文學(xué),天然植物色素的提取與開發(fā)應(yīng)用[J].河南科技大學(xué)學(xué)報，2003（6）；68~65.[2]張奇志,賴來展廖均元黑色食品的營養(yǎng)與功能研究進展[J].糧油食品科技,2006,14(6):11–14.[3]趙肅清,孫遠明.天然黑色素的研究進展[J].廣州食品工業(yè)科技,53~55.[4]江友興,劉希貞,龍小黎.黑米成分分析與功能利用[J].1999(8).[5]鐘麗玉,胡秋林.黑米色素分子結(jié)構(gòu)解析[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報,1996,(1):33-38.[6]陸國權(quán),吳小榮.黑豆皮色素的提取及理化性質(zhì)的研究[J].中國糧油學(xué)報,1997,(3):53-58.[7]王新平,李加新.黑糯米中黑色素提取方法的研究[J].食品科學(xué),1997,(2):44-46.[8]郭金耀,楊曉玲.葡萄皮色素的提取及其性能研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1994(4):415-418.[9]高居易,檀東飛,陳偉生.楊梅水溶性紅色色素的提取和性質(zhì)的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2001,(2):59-62.[10]郭振庫,金欽漢.微波萃取技術(shù)[J]-分析科學(xué)學(xué)報,2001(6).[11]周旭章,魏開華.從黑芝麻中提取黑色素的研究[J].林產(chǎn)化工通訊,1997,(4):16-19.[12]魯京蘭,申風(fēng)善,太俊哲.黑玉米中黑色素的提取[J].延邊大學(xué)學(xué)報,2002,(2)96-98.[13]紀(jì)寶臣.食品黑色素的提取方法[P].中國專利;112