微生物制藥下游技術(shù)

微生物制藥下游技術(shù)第1頁/共170頁2?#?微生物制藥下游技術(shù)3.1引言3.2微生物破壁3.3沉淀法3.4吸附法3.5溶劑萃取3.6兩水相萃取法3.7膜分離第2頁/共170頁3?#?3.8色譜的基本原理和參數(shù)3.9離子交換色譜3.10擴(kuò)展床吸附分離3.11凝膠色譜3.12親和色譜3.13疏水作用色譜3.14結(jié)晶法微生物制藥下游技術(shù)第3頁/共170頁4?#?3.1.1生物下游技術(shù)的特點(diǎn)1、培養(yǎng)物中所含欲提取的生物物質(zhì)濃度很低，但雜質(zhì)含量很高；2、欲分離的生物分子通常很不穩(wěn)定，高熱、極端pH、有機(jī)溶劑等都會導(dǎo)致失活；3、發(fā)酵培養(yǎng)常常是分批發(fā)酵，各批次發(fā)酵液的組成與性質(zhì)不盡相同。下游加工過程應(yīng)遵循的原則：1、時間短；2、溫度低；3、pH適當(dāng)；4、勤清洗消毒。3.1引言第4頁/共170頁5?#?3.1.2生物技術(shù)的一般流程和單元操作3.1.2.1一般工藝流程下游加工過程一般可以分為4個階段：1、發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離；2、初步純化（提?。?；3、高度純化（精制）；4、成品加工。

一般工藝流程：發(fā)酵液預(yù)處理細(xì)胞分離細(xì)胞破碎細(xì)胞碎片分離初步純化高度純化成品加工第5頁/共170頁6?#?第6頁/共170頁7?#?3.1.2.2發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離發(fā)酵液預(yù)處理的目的在于改變發(fā)酵液的性質(zhì)，以便固液分離。在活性物質(zhì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，通過酸化、加熱以降低發(fā)酵液的黏度，或加入絮凝劑，使細(xì)胞或溶劑的大分子聚結(jié)成較大的顆粒。實(shí)驗(yàn)室常用的固液分離的方法有離心和過濾。工業(yè)常用的固液分離方法有：鼓式真空過濾機(jī)、離心機(jī)、硅藻土過濾機(jī)等。第7頁/共170頁8?#?3.1.2.3細(xì)胞破碎及碎片的分離細(xì)胞破碎的方法：機(jī)械法(超速、碾磨、攪拌等）；生物法（酶解、自溶）；化學(xué)法（有機(jī)溶劑等）。實(shí)驗(yàn)室常用方法：超聲破壁、勻漿機(jī)、組織搗碎、酶解（溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶）、凍融等。大規(guī)模生產(chǎn)常用高壓勻漿器和球磨機(jī)等。勻漿器主要是用液相剪切力和與固定表面撞擊所產(chǎn)生的應(yīng)力，球磨機(jī)主要依靠碾磨。第8頁/共170頁9?#?3.1.2.4初步純化（重在濃縮，也有純化）（1）吸附法主要用于抗生素、氨基酸等小分子物質(zhì)的提取，利用吸附劑與目標(biāo)產(chǎn)物之間的分子引力而將其吸附在吸附劑上。常用的吸附劑有活性炭、氧化鋁和各種離子交換樹脂等?；钚蕴坑玫米顝V泛，但有很多缺點(diǎn)：1、吸附性能不穩(wěn)定；2、選擇性不高；3、可逆性差；4、不能連續(xù)操作；5、碳粉還會影響環(huán)境衛(wèi)生。第9頁/共170頁10?#?（2）沉淀法廣泛用于蛋白質(zhì)的提取中，它主要起濃縮作用，純化的效果差。有以下5中類型：A、鹽析B、加入有機(jī)溶劑C、挑pH至等電點(diǎn)D、加入非離子型聚合物E、加入聚電解質(zhì)第10頁/共170頁11?#?（3）溶劑萃取法一般多用于抗生素等小分子生物藥物的提取。原理：處于不同化學(xué)狀態(tài)的抗生素，在水及水不互溶的溶劑中有不同的溶解度。（4）雙水相萃取法多適合蛋白質(zhì)的提取。聚合物分子有不相容性，兩種聚合物的水溶液可以分為兩相。由于蛋白質(zhì)極性的差異，蛋白質(zhì)分子可以在兩相間進(jìn)行分配。影響分配系數(shù)的因素有：聚合物的種類和濃度、聚合物的分子量、離子的種類、離子強(qiáng)度、pH和溫度等。第11頁/共170頁12?#?（5）離子交換法主要用于蛋白質(zhì)、氨基酸及抗生素等兩性帶電生物分子的提取。離子交換法利用離子交換樹脂和生物分子之間的化學(xué)親和力，有選擇性地將生物質(zhì)吸附上去，然后用較少量的洗脫劑將其洗脫下來。（6）超濾法適合于超濾膜分離的物質(zhì)，分子量在500-1000000Da之間，或分子顆粒大小近似在1-10nm之間。超濾是利用不同截留分子量的超濾膜進(jìn)行溶質(zhì)分離或濃縮的技術(shù)。第12頁/共170頁13?#?3.1.2.5精制通過初步純化后，體積已大為縮小，但純度不高，需進(jìn)一步精制。大分子物質(zhì)的精制一般用色譜分離，小分子物質(zhì)的精制一般利用結(jié)晶。（1）色譜分離色譜操作多是在柱中進(jìn)行，有固定相和流動相兩部分，根據(jù)物質(zhì)在兩相間分配系數(shù)不同，在柱中的保留值也不同而獲得分離。第13頁/共170頁14?#?（2）結(jié)晶主要用于低分子量物質(zhì)的純化。結(jié)晶的前題條件是溶液要達(dá)到過飽和。達(dá)到過飽和的方法有：A、加入某些物質(zhì)，改變?nèi)軇┢胶恻c(diǎn)；B、將溶液冷卻或?qū)⑷軇┱舭l(fā)；C、正確控制溫度、溶劑的加入量和加料速度可以控制晶體的生長。第14頁/共170頁15?#?3.1.2.6成品加工（1）濃縮

濃縮可以采用升膜或降膜式的薄膜蒸發(fā)，對熱敏性物質(zhì)，可以采用離心薄膜蒸發(fā)器，而且可以處理黏度大的物料。優(yōu)點(diǎn)：能耗低，成本低。（2）無菌過濾和去熱原傳統(tǒng)去熱原方法是蒸餾或石棉板過濾法，另外活性炭吸附、色譜操作、超濾和萃取等都有除菌和去熱原的效果。第15頁/共170頁16?#?（3）填充劑添加分離濃縮后的樣品需添加填充劑或保護(hù)劑，以保護(hù)產(chǎn)品在進(jìn)一步干燥和儲藏過程中的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)藥物中常用海藻糖和蔗糖。（4）干燥當(dāng)終產(chǎn)品為固體時，一般需要干燥，以除去殘留的水分或溶劑。常用的干燥方法有真空干燥、紅外線干燥、沸騰干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。干燥方法的選擇應(yīng)根據(jù)物料的性質(zhì)和狀態(tài)而定。第16頁/共170頁17?#?3.2微生物破壁

微生物的代謝產(chǎn)物有的分泌到細(xì)胞或組織之外，還有許多是存在于細(xì)胞內(nèi)部。對于胞外產(chǎn)物只需直接將發(fā)酵液預(yù)處理及過濾，獲得澄清的濾液，作為進(jìn)一步純化的出發(fā)原液。對于胞內(nèi)產(chǎn)物，則需首先收集菌體，進(jìn)行細(xì)胞破碎，使代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中，然后，再進(jìn)行細(xì)胞碎片的分離。細(xì)胞破碎是為了破壞細(xì)胞外圍使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。微生物的細(xì)胞外圍通常包括細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。細(xì)胞膜主要由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成，強(qiáng)度比較差，易受滲透壓沖擊而破碎。細(xì)胞破碎的主要阻力來自于細(xì)胞壁。第17頁/共170頁18?#?細(xì)胞壁的組成和破碎阻力細(xì)菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度，如果交聯(lián)程度大，則網(wǎng)結(jié)構(gòu)就致密。酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)，主要阻力來自于壁結(jié)構(gòu)交換的緊密程度和厚度。真菌：多糖，蛋白質(zhì)，脂類，葡聚糖，幾丁質(zhì)，主要阻力來自于壁強(qiáng)度和聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強(qiáng)度高。back第18頁/共170頁19?#?各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成

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為了破碎細(xì)胞，必須克服的主要阻力是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價鍵。各種微生物的細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成差異很大，壁結(jié)構(gòu)不僅取決于遺傳信息，也取決于生長的環(huán)境。在用酶法或化學(xué)法來溶解細(xì)胞壁時，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成顯得特別重要，可用來作為選擇溶菌酶和化學(xué)方法的依據(jù)。第20頁/共170頁21?#?細(xì)胞破碎主要方法

第21頁/共170頁22?#?機(jī)械破碎法與非機(jī)械法比較

第22頁/共170頁23?#?3.2.1機(jī)械方法為了粉碎微生物細(xì)胞，常常選擇機(jī)械的方法，因?yàn)樗鼈兊奶幚砹看?，破碎速度較快。采用這些方法，細(xì)胞受到由高壓產(chǎn)生的高剪切力，但在大多數(shù)情況下要采取冷卻措施，以便除去由于消耗機(jī)械能而產(chǎn)生的過多熱量，防止生化物質(zhì)破壞。第23頁/共170頁24?#?3.2.1.1珠磨機(jī)研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使達(dá)到細(xì)胞的某種程度破碎。

Mickle高速組織搗碎機(jī)和Braun勻漿器是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎設(shè)備，利用玻璃小珠撞擊微生物細(xì)胞而達(dá)到破碎的目的。另外，較大量的微生物細(xì)胞可用膠體磨來處理。這些裝置的主要缺點(diǎn)是在破碎期間樣品溫度迅速升高，通過用干冰來冷卻容器可得到部分解決。第24頁/共170頁25?#?在工業(yè)規(guī)模的破碎中，可以采用高速珠磨機(jī)。在這種設(shè)備中，由于圓盤的高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和玻璃珠相互攪動，細(xì)胞的破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料的滾動而引起的。破碎作用是相對于時間的一級反應(yīng)速度過程，符合下列公式：

ln［l／（l一R）］＝Kt

其中：K—一級反應(yīng)速度常數(shù)；t—時間；R—破碎率。一級反應(yīng)速度常數(shù)K與許多操作參數(shù)有關(guān)，第25頁/共170頁26?#?例如珠體的直徑，進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞濃度和負(fù)荷，料液的流速，攪拌器的轉(zhuǎn)速和構(gòu)型，以及溫度等。這些參數(shù)不僅影響破碎程度，也影響所需能量。珠體的大小應(yīng)根據(jù)細(xì)胞大小和濃度以及在連續(xù)流動的操作過程中不使珠體帶出來選擇，珠體在磨室中的裝量影響破碎程度和所需能量，破碎面包酵母菌適宜的珠體裝量為80％，珠體量的增加使熱擴(kuò)散性能降低而引起溫度升高。

增加攪拌速度能提高破碎效率，但過高的速度反而會使破碎率降低，能量消耗增大，所以攪拌轉(zhuǎn)速應(yīng)適當(dāng)。第26頁/共170頁27?#?3.2.1.2高壓勻漿器

采用高壓勻漿器是大規(guī)模破碎細(xì)胞的常用方法。利用高壓迫使細(xì)胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)造成細(xì)胞破裂。在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對于酵母菌等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。其破碎屬于一級反應(yīng)速度過程，被破碎的細(xì)胞分率符合公式：第27頁/共170頁28?#?ln[1／（l－R）]＝KNPα其中：R——破碎率；K——與溫度有關(guān)的速度常數(shù)；P——操作壓力；N——懸浮液通過勻漿器閥的次數(shù)。α——與微生物種類有關(guān)的常數(shù)；

破碎酵母菌,α值可取2.2。可見，影響破碎的主要因素是壓力、溫度和通過勻漿器閥的次數(shù)。第28頁/共170頁29?#?3.2.1.3X－press法一種改進(jìn)的高壓方法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至－25℃至－30℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，包埋在冰中的微生物的變形所引起的。此法稱為X－press法，主要用于實(shí)驗(yàn)室中。該法對冷冰－融解敏感的生化物質(zhì)不適用。第29頁/共170頁30?#?3.2.1.4超聲波法超聲波破碎也是應(yīng)用較多的一種破碎方法。通常采用的超聲波破碎機(jī)在15到25千赫（kHz）的頻率下操作，細(xì)胞的破碎是由于超聲波的空穴作用。這種空穴泡由于又受到超聲波的迅速沖擊而閉合，從而產(chǎn)生一個極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由它引起的粘附性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細(xì)胞破碎。超聲波振蕩容易引起溫度的劇烈上升，操作時可以在細(xì)胞懸浮液中投入冰或在夾套中通入冷卻劑進(jìn)行冷卻。第30頁/共170頁31?#?3.2.2非機(jī)械方法許多種非機(jī)械方法都適用于微生物細(xì)胞的破碎，包括酶解、滲透壓沖擊，凍結(jié)和融化、熱處理、化學(xué)法溶胞等，其中某些方法的應(yīng)用是有限制的。3.2.2.1酶解法酶解法是利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵，從而達(dá)到破壁目的。應(yīng)用酶解需要選擇適宜的酶和酶系統(tǒng)，并要決定特定的反應(yīng)條件，還常附加其它的處理，如輻照、加高濃度鹽及EDTA，或者利用生物因素等促使微生物對酶解作用敏感，以獲得一定的效果。第31頁/共170頁32?#?酶解的優(yōu)點(diǎn)是專一性強(qiáng)，發(fā)生酶解的條件溫和。溶菌酶是應(yīng)用最多的酶，它能專一地分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子的β一l，4糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處理后的細(xì)胞移至低滲溶液中使細(xì)胞破裂。自溶作用是酶解的另一種方法，微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合結(jié)構(gòu)的酶，以便使生長過程進(jìn)行下去。改變微生物的環(huán)境，可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。

第32頁/共170頁33?#?影響自溶過程的因素有溫度、時間、pH緩沖液濃度、細(xì)胞代謝途徑等。微生物細(xì)胞的自溶常采用加熱法或干燥法。但是，對不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后的細(xì)胞培養(yǎng)液過濾速度也會降低。采用抑制細(xì)胞壁合成的方法能導(dǎo)致類似于酶解的結(jié)果。某些抗生素如青霉素或環(huán)絲氨酸，能阻止新細(xì)胞壁物質(zhì)的合成。抑制劑應(yīng)在發(fā)酵過程細(xì)胞生長期的后期加入。只有當(dāng)抑制劑加入后，生物合成和再生還在繼續(xù)進(jìn)行，溶胞的條件才是有利的。第33頁/共170頁34?#?

3.2.2.2滲透休克法

滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達(dá)到平衡后，介質(zhì)被突然稀釋，或者將細(xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞壁的破裂。滲透壓沖擊的方法僅對細(xì)胞壁較脆弱的菌，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理，或合成受抑制而強(qiáng)度減弱時才是合適的。第34頁/共170頁35?#?3.2.2.3凍融法反復(fù)凍結(jié)—融化，可用于某些細(xì)胞的破碎，或釋放某些細(xì)胞組分。凍結(jié)—融化法系將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍和室溫下融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加了細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞突然膨脹而破裂。對于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。但通常破碎率很低，即使反復(fù)循環(huán)多次也不能提高收率。另外，還可能引起對凍融敏感的某些蛋白質(zhì)的變性。第35頁/共170頁36?#?3.2.2.4干燥法可采用空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥和冷凍干燥等。它使細(xì)胞膜滲透性改變，當(dāng)用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。

空氣干燥主要適用于酵母菌，一般在25－30℃的氣流中吹干，然后用水、緩沖液或其它溶劑抽提。空氣干燥時，部分酵母可能產(chǎn)生自溶。

真空干燥適用于細(xì)菌的干燥。

冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)，將冷凍干燥后的菌體在冷冰條件下磨成粉，然后用緩沖液抽提。第36頁/共170頁37?#?此外，還能用有機(jī)溶劑，例如丙酮、二氧六圜等使細(xì)胞脫水，即可將菌體懸浮液慢慢倒入10倍體積預(yù)冷至－20℃的丙酮中攪拌，使之脫水，丙酮除能脫水外，還能溶解除去膜上部分脂肪，所以更容易抽提。干燥法條件變化較劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性。此外還可以采用化學(xué)法處理來溶解細(xì)胞或提取細(xì)胞組分。例如酸堿及表面活性劑處理，可以使蛋白質(zhì)水解，細(xì)胞溶解或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來。第37頁/共170頁38?#?除上述方法外，某些脂溶性溶劑也能作為化學(xué)處理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，這些試劑容易引起生化物質(zhì)破壞，還會帶來分離和回收化學(xué)物質(zhì)的問題。選擇合適的破碎方法需要考慮下列因素：細(xì)胞的數(shù)量，所需要的產(chǎn)物對破碎條件（溫度、化學(xué)試劑、酶等）的敏感性；要達(dá)到的破碎程度及破碎所必要的速度等，希望盡可能采用最溫和的方法。具有大規(guī)模應(yīng)用潛力的生化產(chǎn)品還應(yīng)選擇適合于放大的破碎技術(shù)。第38頁/共170頁39?#?2008-4-223.3沉淀法沉淀法概述（濃縮作用大于純化作用）沉淀法的原理：利用物質(zhì)能和某些酸、堿或鹽形成不溶性或復(fù)合物沉淀或結(jié)晶。加酸、堿、鹽、有機(jī)溶劑、其它物質(zhì)。沉淀法的優(yōu)點(diǎn)：成本低、收率高、適當(dāng)條件下不會使蛋白質(zhì)等大分子變性，濃縮倍數(shù)高和操作簡單等。第39頁/共170頁40?#?2008-4-22根據(jù)所加入沉淀劑的不同，沉淀法可分為：鹽析等電點(diǎn)有機(jī)溶劑非離子型聚合物聚電解質(zhì)高價金屬離子第40頁/共170頁41?#?

①鹽析法；多用于分離純化各種蛋白質(zhì)和酶。

②有機(jī)溶劑沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸等產(chǎn)品的分離純化，也有用于蛋白質(zhì)的沉淀。

③等電點(diǎn)沉淀法：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀。④生成鹽復(fù)合物沉淀法：用于多種化合物，特別是小分子物質(zhì)的沉淀。第41頁/共170頁42?#?3.3.1鹽析法(1)鹽溶：[鹽]低時，蛋白質(zhì)S隨[鹽]增加而增加；第42頁/共170頁43?#?(2)鹽析：[鹽]高時，蛋白質(zhì)S隨[鹽]增加而降低；第43頁/共170頁44?#?鹽析機(jī)理示意圖

第44頁/共170頁45?#?2008-4-22鹽析的機(jī)理蛋白膠體穩(wěn)定的原因是蛋白質(zhì)顆粒周圍水化膜和電荷的存在。加入鹽，中和表面電荷、破壞水化膜。①鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，降低了用于溶解蛋白質(zhì)的有效水量，減弱了蛋白質(zhì)的水合程度，破壞了蛋白表面的水化膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降；②鹽離子電荷的中和作用，使蛋白質(zhì)溶解度下降；③鹽離子引起原本在蛋白質(zhì)分子周圍有序排列的水分子的極化，使水活度降低。第45頁/共170頁46?#?2008-4-22蛋白質(zhì)的溶解度與鹽濃度的關(guān)系可用下式表示：

logS=β－KS·IS：蛋白質(zhì)的溶解度；

I：離子強(qiáng)度；

β：常數(shù)，與蛋白質(zhì)種類有關(guān)，與鹽的種類無關(guān)；

KS：鹽析常數(shù)，與鹽種類有關(guān)，與溫度和pH無關(guān);第46頁/共170頁47?#?影響鹽析的主要因素1）蛋白質(zhì)濃度與鹽析的關(guān)系：高濃度蛋白質(zhì)溶液可以減少鹽的用量，但蛋白質(zhì)濃度太高，會發(fā)生嚴(yán)重的共沉作用；用低濃度蛋白溶液進(jìn)行鹽析，需用較多的鹽，共沉作用較輕。2）離子強(qiáng)度和種類的影響：鹽溶：許多蛋白在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶現(xiàn)象（比在純水中的溶解度大大增加）；高鹽濃度則鹽析，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低；鹽析劑種類很多，不同種類的鹽對蛋白溶解度的影響是不同的；離子半徑小且電荷高的離子對鹽析作用的影響較強(qiáng)，離子半徑較大而電荷低的離子影響較弱；不同種類的鹽對溶解度的影響，主要是對Ks值的影響，Ks值越大，該鹽的鹽析效果越好。第47頁/共170頁48?#?3）溫度對鹽析的影響：溫度是影響溶質(zhì)溶解度的重要因素，升高溫度可以增加許多無機(jī)鹽和小分子有機(jī)化合物的溶解度；但在高鹽濃度中，蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)的溶解度隨溫度的升高反而減小，這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子在水化時要吸熱，失水時則放熱；溫度升高有利于蛋白質(zhì)失水沉淀。4）PH對鹽析的影響：值除與蛋白質(zhì)和溫度有關(guān)外，還與pH有關(guān)；鹽析pH的選擇要以不降低產(chǎn)物的活性為原則；由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時最易沉淀，故可選擇等電點(diǎn)的pH作為鹽析pH。第48頁/共170頁49?#?影響鹽析的主要因素鹽溶：許多蛋白在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶現(xiàn)象；高鹽濃度則鹽析，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低；鹽析劑種類很多，不同種類的鹽對蛋白溶解度的影響是不同的；離子半徑小且電荷高的離子對鹽析作用的影響較強(qiáng)，離子半徑較大而電荷低的離子影響較弱；不同種類的鹽對溶解度的影響，主要是對Ks值的影響，，Ks值越大，該鹽的鹽析效果越好。1）蛋白質(zhì)濃度

高濃度的蛋白溶液，可減少鹽的用量；但共沉現(xiàn)象嚴(yán)重用低濃度蛋白溶液進(jìn)行鹽析，需用較多的鹽，共沉作用較輕。2）離子強(qiáng)度和種類3）溫度溫度是影響溶質(zhì)溶解度的重要因素，升高溫度可以增加許多無機(jī)鹽和小分子有機(jī)化合物的溶解度；但在高鹽濃度中，蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)的溶解度隨溫度的升高反而減小這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子在水化時要吸熱，失水時則放熱；溫度升高有利于蛋白質(zhì)失水沉淀。4）pH值除與蛋白質(zhì)和溫度有關(guān)外，還與pH有關(guān)；鹽析pH的選擇要以不降低產(chǎn)物的活性為原則；由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時最易沉淀，故可選擇等電點(diǎn)的pH作為鹽析pH第49頁/共170頁50?#?無機(jī)鹽種類的影響不同鹽溶液中碳氧血紅蛋白的溶解度與離子強(qiáng)度的關(guān)系（25℃）

(○)NaCl;(▼)KCl;(?)MgSO4;(▲)NH4)SO4;(●)Na2SO4;(□)K2SO4;(■)檸檬酸三鈉第50頁/共170頁51?#?2008-4-223.3.2、等電點(diǎn)沉淀法原理：利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)的溶解度最低和不同電解質(zhì)有不同等電點(diǎn)的特性，將兩性電解質(zhì)分離的方法。通過加酸或堿調(diào)pH＝pI，蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零，分子聚集在一起。中性鹽的濃度增加時，相應(yīng)于最低溶解度的pH值向偏酸方向移動；同時最低溶解度會有所增大。第51頁/共170頁52?#?優(yōu)點(diǎn)：許多蛋白的等電點(diǎn)都在偏酸范圍內(nèi)，而許多無機(jī)酸的價格低廉，并能為食品標(biāo)準(zhǔn)允許；缺點(diǎn)：酸化時易引起蛋白失活，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)對低PH比較敏感。許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)比較接近，故選擇性不高。

不少蛋白質(zhì)與金屬結(jié)合后會發(fā)生等電點(diǎn)偏移，如胰島素的等電點(diǎn)為5.3，在與Zn2+結(jié)合形成胰島素鋅鹽，其等電點(diǎn)升為6.2；故加入金屬離子后選擇等電點(diǎn)沉淀時，要注意調(diào)整pH。第52頁/共170頁53?#?等電點(diǎn)沉淀實(shí)例

從豬胰臟中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，除去共存的許多酸性蛋白質(zhì)(pI=3.0)。工業(yè)生產(chǎn)胰島素(pI＝5.3)時，先調(diào)pH至8.0除去堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)pH至3.0除去酸性蛋白質(zhì)(同時加入一定濃度的有機(jī)溶劑以提高沉淀效果)。第53頁/共170頁54?#?2008-4-223.3.3有機(jī)溶劑沉淀法利用某些物質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使其分離的方法。1.原理：許多有機(jī)溶劑如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生物物質(zhì)以及核酸、多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生沉淀作用，這種沉淀作用是多種效應(yīng)的結(jié)果，但主要作用是降低水溶液的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子間因引力而凝集。或破壞水膜(降低水活度)而溶解度降低；或破壞蛋白質(zhì)的肽鍵，改變其空間結(jié)構(gòu)而使疏水基團(tuán)暴露而析出。第54頁/共170頁55?#?

當(dāng)有機(jī)溶劑濃度增大時，水對蛋白等分子表面上荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，或者說溶劑的介電常數(shù)降低，因而靜電吸引力增大，帶電溶質(zhì)互相吸引而聚集。

對于具有表面水層的生物分子，有機(jī)溶劑與水的作用，使這些分子表面水層厚度不斷壓縮，最后使這些分子脫水而相互聚集析出。

不同濃度的有機(jī)溶劑可使不同的溶質(zhì)沉淀，即分步沉淀法，達(dá)到分離純化的目的。第55頁/共170頁56?#?2、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：分辨能力比鹽析法高；一種溶質(zhì)只在一個比較窄的有機(jī)溶劑范圍內(nèi)沉淀；沉淀不需脫鹽；有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，容易進(jìn)行固液分離；有機(jī)溶劑容易蒸發(fā)，不會在成品中殘留，因此適用于食品、藥品的制備。缺點(diǎn)：容易引起蛋白質(zhì)變性失活，有機(jī)溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。需冷卻、降溫、低溫操作。對同一種溶劑，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量越大，沉淀所需有機(jī)溶劑的量越少。第56頁/共170頁57?#?3.影響有機(jī)溶劑沉淀的因素1、有機(jī)溶劑的種類：選擇的溶劑必須能與水互溶，但與產(chǎn)物如蛋白質(zhì)等不發(fā)生反應(yīng)。例如：乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、氯仿、乙醚等；乙醇是核酸、糖類、氨基酸和核苷酸等物質(zhì)最常用的沉淀劑；在沉淀過程中，乙醇與水混合時放出大量的稀釋熱，使溶液的溫度顯著升高，這對熱穩(wěn)定性較差的產(chǎn)物影響較大（少量多次、攪拌）2、溫度：多數(shù)生物物質(zhì)在有機(jī)溶劑與水的混合液中的溶解度是隨溫度的降低而降低的，降低溫度可以增加收率。同時許多生物分子如蛋白質(zhì)、核酸等對溫度特別敏感，溫度稍有升高，便發(fā)生變性；低溫沉淀還能更好地保護(hù)生物物質(zhì)的活性。第57頁/共170頁58?#?3、pH：在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定范圍內(nèi)，選擇溶解度最低時的pH，有助于提高沉淀效果。因此在接近等電點(diǎn)處，以引起沉淀所需有機(jī)溶劑的量較少。合適的PH也可大大提高分離的分辨能力。4、樣品濃度和分子質(zhì)量：低濃度樣品需用有機(jī)溶劑的量較大，但共沉作用小，有利于提高分離的效果；但低濃度樣品損失較大，回收率低，具有生理活性的樣品容易產(chǎn)生稀釋變性。高濃度樣品使用有機(jī)溶劑的量較小，減少了變性的危險；但共沉作用大，分離效果較差。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量越大，產(chǎn)生沉淀所需加入的有機(jī)溶劑量越少。5、金屬離子和離子強(qiáng)度：Mn2+、Fe2+、Co2+、Zn2+等陽離子能與蛋白質(zhì)中的羧基、氨基和含有氮雜環(huán)的化合物結(jié)合，形成難溶復(fù)合物，有利于沉淀。但離子強(qiáng)度過大，不利分離。Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+能與羧基結(jié)合；Ag+、Hg2+能與巰基結(jié)合形成復(fù)合物；這類復(fù)合物在水或有機(jī)溶劑中的溶解度都大大降低，而不影響蛋白質(zhì)的生物活性，同時還能降低有機(jī)溶劑的用量。第58頁/共170頁59?#?用于生物物質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑須能與水互溶，但對蛋白無作用；例如：乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、氯仿、乙醚等；乙醇是核酸、糖類、氨基酸和核苷酸等物質(zhì)最常用的沉淀劑；在沉淀過程中，乙醇與水混合時放出大量的稀釋熱，使溶液的溫度顯著升高，這對熱穩(wěn)定性較差的產(chǎn)物影響較大（少量多次、攪拌）3、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素1）有機(jī)溶劑的種類2）溫度多數(shù)生物物質(zhì)在有機(jī)溶劑與水的混合液中的溶解度是隨溫度的降低而降低的，因此降低溫度可增加收率；低溫沉淀還能更好地保護(hù)生物物質(zhì)的活性。3）pH在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定范圍內(nèi)，選擇溶解度最低時的pH，有助于提高沉淀效果；在接近等電點(diǎn)處，引起沉淀所需有機(jī)溶劑的量最??；合適的pH還可大大提高分離的分辨能力4）樣品濃度和分子質(zhì)量低濃度樣品需要使用有機(jī)溶劑的量較大，但共沉作用小，有利于提高分離的效果；但低濃度樣品損失較大，回收率低；高濃度樣品使用有機(jī)溶劑的量較小，減少了變性的危險；但共沉作用大，分離效果較差。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量越大，產(chǎn)生沉淀所需加入的有機(jī)溶劑量越少。5）金屬離子和離子強(qiáng)度

Mn2+、Fe2+、Co2+、Cu2+、Zn2+

等離子能與蛋白質(zhì)的羧基、氨基和含有氮雜環(huán)的化合物結(jié)合；

Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+能與羧基結(jié)合；

Ag+、Hg2+、Pb2+

能與巰基結(jié)合形成復(fù)合物；某些有機(jī)化合物能與生物大分子形成難容的復(fù)合物.這類復(fù)合物在水或有機(jī)溶劑中的溶解度都大大降低，而不影響蛋白質(zhì)的生物活性，同時還能降低有機(jī)溶劑的用量。第59頁/共170頁60?#?有機(jī)溶劑沉淀實(shí)例第60頁/共170頁61?#?2008-4-22其他方法：非離子型聚合物沉淀法：與有機(jī)溶劑相似，能降低水化度。聚電解質(zhì)：作用機(jī)制復(fù)雜，有絮凝作用，也有鹽析作用，還有降低水化等作用。金屬離子：可沉淀低濃度蛋白質(zhì)第61頁/共170頁62?#?3.4吸附法吸附:指物質(zhì)從流動相濃縮到固體表面從而達(dá)到分離的過程稱為吸附作用。(該過程包括兩相:液相(氣相)→固相)

表面能發(fā)生吸附作用的固體稱為吸附劑(吸附介質(zhì)),一般為多孔微?；蚨嗫啄ぁ１晃降娜苜|(zhì)稱為吸附物。第62頁/共170頁63?#?吸附法的特點(diǎn)：常用于從稀溶液中將溶質(zhì)分離出來，由于受固體吸附劑的限制，處理能力較??；對溶質(zhì)的作用較小，這一點(diǎn)在蛋白質(zhì)分離中特別重要；可直接從發(fā)酵液中分離所需的產(chǎn)物，成為發(fā)酵與分離的耦合過程，從而可消除某些產(chǎn)物對微生物的抑制作用；溶質(zhì)和吸附劑之間的相互作用及吸附平衡關(guān)系通常是非線性關(guān)系，故設(shè)計(jì)比較復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)的工作量較大。第63頁/共170頁64?#?優(yōu)點(diǎn)：有機(jī)溶劑摻入少；操作簡便，安全，設(shè)備簡單；

pH變化小，適于穩(wěn)定性差的物質(zhì)。缺點(diǎn)：選擇性差；收率低；無機(jī)吸附劑性能不穩(wěn)定；不能連續(xù)操作，勞動強(qiáng)度大；碳粉等吸附劑有粉塵污染。第64頁/共170頁65?#?1、吸附機(jī)制：固體表面分子(或原子)處于特殊的狀態(tài)。固體內(nèi)部分子所受的力是對稱的，故彼此處于平衡。但在界面分子的力場是不飽和的，即存在一種固體的表面力，它能從外界吸附分子、原子、或離子，并在吸附表面上形成多分子層或單分子層。第65頁/共170頁66?#?2、吸附的類型

物理吸附:

吸附劑和吸附物通過分子力產(chǎn)生的吸附。

特點(diǎn)：是放熱過程；吸附物分子狀態(tài)變化不大，需要的活化能很小，多數(shù)在較低溫下進(jìn)行；達(dá)吸附平衡時間非常短；吸附過程可逆。第66頁/共170頁67?#?化學(xué)吸附：化學(xué)吸附是由于吸附劑和吸附物之間的電子轉(zhuǎn)移，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生。

特點(diǎn)：釋放大量的熱；選擇性較強(qiáng)；單分子層吸附，穩(wěn)定，不易解吸。第67頁/共170頁68?#?物理吸附和化學(xué)吸附的比較

物理吸附化學(xué)吸附吸附力范德華力化學(xué)鍵力吸附熱較小(～液化熱)較大選擇性無選擇性有選擇性穩(wěn)定性不穩(wěn)定,易解吸穩(wěn)定分子層單分子層或多分子層單分子層吸附速率較快,較慢.

受溫度影響小受溫度影響大物理吸附僅僅是一種物理作用，沒有電子轉(zhuǎn)移，沒有化學(xué)鍵的生成與破壞，也沒有原子重排等。化學(xué)吸附相當(dāng)與吸附劑表面分子與吸附質(zhì)分子發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。第68頁/共170頁69?#?

交換吸附：

1、極性吸附:

吸附劑表面如為極性分子所組成，則會吸引溶液中呈相反極性的物質(zhì)或離子而形成雙電層，這種吸附稱為極性吸附。

2、離子交換:

在吸附劑與溶液間發(fā)生離子交換，即吸附劑吸附離子后，它同時要放出等量的離子于溶液中。離子所帶電荷越多，它在吸附劑表面的相反電荷點(diǎn)上的吸附力就越大；電荷相同的離子，其水化半徑越小，越容易被吸附。第69頁/共170頁70?#?3、吸附力的本質(zhì)吸附作用最根本因素是吸附質(zhì)和吸附劑之間的作用力：范德華力：

定向力:極性分子之間產(chǎn)生的作用力，由極性分子的永久偶極距產(chǎn)生的分子間的靜電力。

誘導(dǎo)力：極性與非極性分子之間引力，極性分子產(chǎn)生的電場作用會誘導(dǎo)非極性分子極化,產(chǎn)生誘導(dǎo)偶極距，因此兩者之間相互吸引。

色散力：非極性分子之間引力，瞬時偶極距。第70頁/共170頁71?#?吸附劑的類型多孔型：生物產(chǎn)物的脫色，除臭；活性炭，硅膠、硅藻土。大網(wǎng)格吸附劑：有機(jī)高分子材料，如聚苯乙烯，聚酯。凝膠型：纖維素凝膠，瓊脂糖凝膠，匍聚糖凝膠。吸附劑的要求：① 自身不溶解，也不破壞或分解被分離物。② 表面積大。③ 大小均勻。第71頁/共170頁72?#?吸附劑的性能表征比表面積：單位質(zhì)量物體所具有的表面積(m2/g)

測量方法：BET法

一般采用B.E.T(Brunueer-Emmett-Teller)法：在液氮溫度下(-196°C)，用吸附劑吸附氮?dú)?，在吸附劑表面形成單分子吸附層，測定氮?dú)獾奈襟w積vm(cm3/g)，計(jì)算比表面積a(cm2/g): N-阿弗加德羅常數(shù)，s-被吸附分子的橫截面積，在-196°C氮?dú)夥肿拥膕=1.6210-15cm2。第72頁/共170頁73?#?第73頁/共170頁74?#?4、吸附平衡理論吸附是一種平衡分離方法，根據(jù)不同溶質(zhì)在液固兩相間分配平衡的差別實(shí)現(xiàn)分離。當(dāng)溶質(zhì)在液固兩相間達(dá)到吸附平衡時，吸附劑上的平衡吸附質(zhì)濃度q是液相游離溶質(zhì)濃度c和溫度T的函數(shù)。吸附等溫線當(dāng)溫度一定時，平衡吸附量q與液相游離溶質(zhì)濃度c之間的函數(shù)關(guān)系稱為吸附等溫線。第74頁/共170頁75?#?常見吸附平衡等溫線1、指數(shù)型吸附等溫線（線性）：2、多分子型吸附等溫線（非線性）3、單分子型吸附等溫線（非線性）qm：飽和吸附量；Kd：吸附平衡的解離常數(shù)第75頁/共170頁76?#?朗格謬爾吸附平衡（單分子層吸附）

理論基礎(chǔ)：吸附劑上存在許多活性位點(diǎn)，每個活性位點(diǎn)具有相同的能量，只能吸附一個分子，并且被吸附的分子間無相互作用，從而形成單分子吸附層。第76頁/共170頁77?#?2008-4-22

5、影響吸附的因素

1.吸附劑的性質(zhì)

2.吸附物的性質(zhì)

3.溶液的pH4.溫度

5.其它組分第77頁/共170頁78?#?3.5溶劑萃取當(dāng)含有生化物質(zhì)的溶液與互不相溶的第二相接觸時，生化物質(zhì)傾向于在兩相之間進(jìn)行分配，當(dāng)條件選擇得恰當(dāng)時，所需提取的生化物質(zhì)就會有選擇性地發(fā)生轉(zhuǎn)移，集中到一相中，而原來溶液中所混有的其它雜質(zhì)（如中間代謝產(chǎn)物、雜蛋白等）分配在另一相中，這樣就能達(dá)到某種程度的提純和濃縮。萃取在化工上是分離液體混合物常用的單元操作，在發(fā)酵和其它生物工程生產(chǎn)上的應(yīng)用也相當(dāng)廣泛，萃取操作不僅可以提取和增濃產(chǎn)物，使產(chǎn)物獲得初步的純化，所以廣泛應(yīng)用在抗生素、有機(jī)酸、維生素、激素等發(fā)酵產(chǎn)物的提取上。第78頁/共170頁79?#?

溶劑萃取法是利用一種溶質(zhì)組分(如產(chǎn)物)在兩個互不相溶的液相(如水相和有機(jī)溶劑相)中競爭性溶解和分配性質(zhì)上的差異來進(jìn)行分離的操作。優(yōu)點(diǎn)：比化學(xué)沉淀法分離程度高；比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快；比蒸餾法能耗低。還有生產(chǎn)能力大、周期短、便于連續(xù)操作、容易實(shí)現(xiàn)自動化控制等優(yōu)點(diǎn)。第79頁/共170頁80?#?萃取法是利用液體混合物各組分在某有機(jī)溶劑中的溶解度的差異而實(shí)現(xiàn)分離的。料液：在溶劑萃取中，被提取的溶液;溶質(zhì)：其中欲提取的物質(zhì);萃取劑：用以進(jìn)行萃取的溶劑;萃取液：經(jīng)接觸分離后，大部分溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中，得到的溶液;余液：被萃取出溶質(zhì)的料液稱為。第80頁/共170頁81?#?萃取過程第81頁/共170頁82?#?

萃取過程有選擇性能與其它步聚相配合通過相轉(zhuǎn)移減少產(chǎn)品水解適用于不同規(guī)模傳質(zhì)快周期短，便于連續(xù)操作毒性與安全環(huán)境問題溶劑萃取法的特點(diǎn)第82頁/共170頁83?#?1、萃取過程的理論基礎(chǔ)液液萃取是以分配定律為基礎(chǔ)分配定律：一定T、P下，溶質(zhì)在兩個互不相溶的溶劑中分配，平衡時溶質(zhì)在兩相中濃度之比為常數(shù)。K-分配系數(shù)在常溫常壓下Ｋ為常數(shù)；應(yīng)用前提條件（1）稀溶液；（2）溶質(zhì)對溶劑互溶沒有影響；（3）必須是同一分子類型，不發(fā)生締合或離解。第83頁/共170頁84?#?分配定律推導(dǎo)當(dāng)溫度一定時，標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)位為常數(shù)如為稀溶液，用濃度代替活度根據(jù)相律（F=C-P+2），在一定溫度和壓力下萃取達(dá)到平衡時，溶質(zhì)在兩相中的化學(xué)位相等：μL=μH第84頁/共170頁85?#?弱電解質(zhì)在有機(jī)溶劑-水相的分配平衡分配系數(shù)中CL和CH

必須是同一種分子類型，即不發(fā)生締合或離解。對于弱電解質(zhì)，在水中發(fā)生解離，則只有兩相中的單分子化合物的濃度才符合分配定律。

例如青霉素在水中部分離解成負(fù)離子（青COO－），而在溶劑相中則僅以游離酸（青COOH）的形式存在，則只有兩相中的游離酸分子才符合分配定律。此時，同時存在著兩種平衡，一種是青霉素游離酸分子在有機(jī)溶劑相和水相間的分配平衡；另一種是青霉素游離酸在水中的電離平衡。前者用分配系數(shù)K0來表征，后者用電離常數(shù)Kp來表征。對于弱堿性物質(zhì)也有類似的情況。

第85頁/共170頁86?#?青霉素的分配平衡第86頁/共170頁87?#?分離因素（β）如果原來料液中除溶質(zhì)A以外，還含有溶質(zhì)B，則由于A、B的分配系數(shù)不同，萃取相中A和B的相對含量就不同于萃余相中A和B的相對含量。如A的分配系數(shù)較B大，則萃取相中A的含量（濃度）較B多，這樣A和B就得到一定程度的分離。萃取劑對溶質(zhì)A和B分離能力的大小可用分離因素（β）來表征。第87頁/共170頁88?#?分離因素表示有效成分A與雜質(zhì)B的分離程度。ＫＡ

β=ＫＢ

β=1KA=KB

分離效果不好；β>1KA>KB

分離效果好；β越大，KA

越大于KB，分離效果越好。分離因素（β）第88頁/共170頁89?#?2、有機(jī)溶劑的選擇選擇原則：根據(jù)相似相溶的原理(最重要參數(shù)：介電常數(shù)，極性)，選擇與目標(biāo)產(chǎn)物性質(zhì)相近的萃取劑，可以得到較大分配系數(shù)。此外，有機(jī)溶劑還應(yīng)滿足以下要求：1)、價廉易得；2)、與水相不互溶；3)、與水相有較大的密度差，并且粘度小，表面張力適中，相分散和相分離較容易；第89頁/共170頁90?#?4)、容易回收和再利用；5)、毒性低，腐蝕性小，閃點(diǎn)低，使用安全；6)、不與目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)。常用于抗生素類萃取劑有：丁醇等醇類、乙酸乙酯、乙酸丁酯和乙酸戊酯等乙酸酯類以及甲異丁基甲酮等。第90頁/共170頁91?#?

3．水相條件的影響

發(fā)酵液中存在與產(chǎn)物性質(zhì)相近的雜質(zhì)、未完全利用的底物、無機(jī)鹽、供微生物生長代謝的其他營養(yǎng)成分等。必須考慮這些物質(zhì)對萃取過程的影響。(1)pH值

直接影響表觀分配系數(shù)。對選擇性有影響。

pH值還應(yīng)盡量選擇在使產(chǎn)物穩(wěn)定的范圍內(nèi)。第91頁/共170頁92?#?2.溫度T

◆溫度會影響生化物質(zhì)的穩(wěn)定性，所以一般在室溫或低溫下進(jìn)行。T↑，分子擴(kuò)散速度↑，故萃取速度↑

◆

T影響分配系數(shù)例：pen―T↑水中的溶解度↑∴萃取時T↓使K↑；紅霉素、螺旋霉素―T↑水中的溶解度↓

∴萃取時T↓使K↑；反萃時T↑使K反↑◆

T影響兩溶劑的互溶度影響；第92頁/共170頁93?#?3.鹽析：一方面，鹽析劑硫酸銨、氯化鈉等可使產(chǎn)物在水中溶解度降低，而易于轉(zhuǎn)入溶劑中去。另一方面，也能減少有機(jī)溶劑在水中溶解度。但過多可能促使雜質(zhì)一起轉(zhuǎn)入溶劑相，必要時要考慮回收。例：pen從水相→丁酯中，加氯化鈉洗滌，消除有機(jī)相水滴，提高質(zhì)量和收率；

spm的丁酯萃取液+飽和鹽水洗滌，減少spm在水中溶解度；消除有機(jī)相水滴；分相容易。第93頁/共170頁94?#?

4、帶溶劑能和產(chǎn)物形成復(fù)合物，使產(chǎn)物更易溶于有機(jī)溶劑相中，提高分配系數(shù)。復(fù)合物又要容易分解。對于水溶性強(qiáng)的溶質(zhì)，可利用脂溶性萃取劑與溶質(zhì)間的化學(xué)反應(yīng)生成脂溶性復(fù)合分子，使溶質(zhì)向有機(jī)相轉(zhuǎn)移。①抗生素萃取劑：月桂酸、脂肪堿或胺類等。②氨基酸萃取劑：氯化三辛基甲銨。溶質(zhì)與帶溶劑之間的作用：離子對萃取、離子交換萃取、反應(yīng)萃取。第94頁/共170頁95?#?萃取百分率

萃取百分率：被萃取物在有機(jī)相中的量占它在兩相中的百分?jǐn)?shù)。第95頁/共170頁96?#?萃取效率

設(shè)：萃取體系中水相的體積為V水，有機(jī)相的體積為V有，則萃取效率可從下式計(jì)算：第96頁/共170頁97?#?對萃取效率公式的討論1．當(dāng)V(水)＝V(有)，即用與試液同體積的有機(jī)溶劑來率取，此時上式為：2．當(dāng)V(水)＝V(有)，而D＝1時，則萃取一次萃取效率為50%；3．若要求萃取百分率大于90%，則D必須大于9；4．當(dāng)分配比不夠大時，一次萃取的效率不達(dá)要求，可采用多次萃取的方法來提高萃取效率。第97頁/共170頁98?#?多次連續(xù)萃取的計(jì)算設(shè)V（水）為水相體積，V（有）為每次加入的有機(jī)相體積，m0為被萃取前試樣中A的質(zhì)量，m1、m2、……mn為1次、2次……n次萃取后水相中剩余的A的質(zhì)量，求m1、m2、……mn？解:經(jīng)一次萃取后留在水相中A的質(zhì)量第98頁/共170頁99?#?第二次萃取后水相中剩余溶質(zhì)質(zhì)量：經(jīng)n次萃取后水相中剩余溶質(zhì)質(zhì)量：n次萃取后的萃取效率E為：第99頁/共170頁100?#?

以CCl4萃取20mL水溶液中的I2，已知碘在水與CCl4的分配比為85，試比較用20mLCCl4一次萃取及每次用10mLCCl4分兩次萃取的萃取效率。解：一次萃取：分兩次萃?。旱?00頁/共170頁101?#?3.6雙水相萃取技術(shù)

溶液的分相不一定完全依賴于有機(jī)溶劑，在一定條件下，水相也可以形成兩相(即雙水相系統(tǒng))甚至多相。于是有可能將水溶性的酶、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)從一個水相轉(zhuǎn)移到另一水相中，從而完成分離任務(wù)。第101頁/共170頁102?#?1、雙水相的形成當(dāng)兩種聚合物互相混合時，究竟是否分層或混合成一相，取決于兩種因素：一體系熵的增加，二分子間作用力。

熵的增加涉及到分子數(shù)量，與分子大小無關(guān)。當(dāng)分子的物質(zhì)的量相同時，大分子與小分子間的混合，熵的增加是相同的。分子間的作用力可看作分子中各基團(tuán)間相互作用力之和。分子量越大，分子間的作用力也越大。大分子間混合，分子間作用力決定混合效果?；旌戏肿娱g如存在空間排斥力，它們的基團(tuán)結(jié)構(gòu)無法互相滲透，則在達(dá)到平衡后就有可能分成兩相，形成雙水相。第102頁/共170頁103?#?將兩種不同的水溶性聚合物的水溶液混合時，當(dāng)聚合物濃度達(dá)到一定值，體系會自然的分成互不相溶的兩相，這就是雙水相體系.形成原因：由于高聚物之間的不相溶性，即高聚物分子的空間阻礙作用，相互無法滲透，不能形成均一相，從而具有分離傾向，在一定條件下即可分為二相。另外，某些聚合物的溶液與某些無機(jī)鹽的溶液相混合時，只要濃度達(dá)到一定值，也會形成兩相，即聚合物—鹽雙水相體系，成相機(jī)理尚不清楚。第103頁/共170頁104?#?第104頁/共170頁105?#?常用的雙水相體系

高聚物/高聚物體系：聚乙二醇(簡稱PEG)/葡聚糖(簡稱Dextran)和PEG/Dextran

高聚物/無機(jī)鹽體系：常見的高聚物/無機(jī)鹽體系為:PEG/硫酸鹽或磷酸鹽體系。第105頁/共170頁106?#?2、相圖兩水相的形成條件和定量關(guān)系常用相圖表示。相圖是一條雙節(jié)線。雙節(jié)線下方為均勻區(qū)，雙節(jié)線上方即為兩相區(qū)，兩相分別有不同的組成和密度。上相組成用T(Top)表示，下相組成用B(Bottom)表示。由圖7-2可知，上相主要含PEG，下相主要含Dex。第106頁/共170頁107?#?（1）聚合物及其分子量的影響

不同聚合物的水相系統(tǒng)顯示出不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性按下列次序遞增:

葡萄糖硫酸鹽<甲基葡萄糖<葡萄糖<羥丙基葡聚糖<甲基纖維素<聚乙烯醇<聚乙二醇<聚丙三醇。3、影響物質(zhì)分配平衡的因素第107頁/共170頁108?#?

同一聚合物的疏水性隨分子量增加而增加，其大小的選擇依賴于萃取過程的目的和方向，在PEG/DEX系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)的分配系數(shù)隨著DEX相對分子量的增加而增加。若想在上相獲得較高的蛋白質(zhì)收率，對于PEG聚合物，應(yīng)降低它的平均分子量，相反，若想在下相獲得較高的蛋白質(zhì)收率，則平均分子量應(yīng)增加。第108頁/共170頁109?#?（2）pH值的影響

改變兩相的電位差；如體系pH值與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相差越大，則蛋白質(zhì)在兩相中分配越不均勻。

pH值的變化也會導(dǎo)致組成體系的物質(zhì)電性發(fā)生變化，也會使被分離物質(zhì)的電荷發(fā)生改變，從而影響分配的進(jìn)行。第109頁/共170頁110?#?（3）離子環(huán)境對蛋白質(zhì)在兩相體系分配的影響在雙水相聚合物系統(tǒng)中，加入電解質(zhì)時，其陰陽離子在兩相間會有不同的分配。同時，由于電中性的約束,存在一穿過相界面的電勢差,它是影響荷電大分子如蛋白質(zhì)和核酸等分配的主要因素。同樣，對于粒子遷移也有相似的影響，粒子因遷移而在界面上積累。故只要設(shè)法改變界面電勢，就能控制蛋白質(zhì)等電荷大分子轉(zhuǎn)入某一相。第110頁/共170頁111?#?（4）溫度的影響

分配系數(shù)對溫度的變化不敏感；成相聚合物對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定化作用,所以室溫操作活性收率依然很高,而且室溫時粘度較冷卻時(4℃)低,有助于相的分離并節(jié)省了能源開支。第111頁/共170頁112?#?雙水相萃取技術(shù)的特點(diǎn)(1)系統(tǒng)含水量多達(dá)75%～90%,兩相界面張力極低(10-7～10–4N·m-1),有助于保持生物活性和強(qiáng)化相際間的質(zhì)量傳遞。(2)分相時間短(特別是聚合物/鹽系統(tǒng)),自然分相時間一般只有5～15min。(3)雙水相分配技術(shù)易于連續(xù)化操作。第112頁/共170頁113?#?(4)目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)一般大于3,大多數(shù)情況下,目標(biāo)產(chǎn)物有較高的收率。(5)大量雜質(zhì)能夠與所有固體物質(zhì)一起去掉,與其它常用固液分離方法相比,雙水相分配技術(shù)可省去1～2個分離步驟,使整個分離過程更經(jīng)濟(jì)。(6)設(shè)備投資費(fèi)用少,操作簡單,不存在有機(jī)溶劑殘留問題。第113頁/共170頁114?#?雙水相萃取的工藝流程雙水相萃取技術(shù)的工藝流程主要由三部分構(gòu)成:目的產(chǎn)物的萃取;PEG的循環(huán);無機(jī)鹽的循環(huán)。第114頁/共170頁115?#?

雙水相萃取技術(shù)目前較多地應(yīng)用于胞內(nèi)酶的提取和精制上。要成功地運(yùn)用雙水相萃取法，應(yīng)滿足下列條件：

(1)欲提取的酶和細(xì)胞碎片應(yīng)分配在不同的相中；

(2)酶的分配系數(shù)應(yīng)足夠大，使在一定的相體積比時，經(jīng)過一次萃取，就能得到較高的收率；

(3)兩相用離心機(jī)很容易分離。第115頁/共170頁116?#?雙水相的應(yīng)用舉例1.分離和提純各種蛋白質(zhì)(酶）

用PEG/-(NH4)2SO4

雙水相體系,經(jīng)一次萃取從α-淀粉酶發(fā)酵液中分離提取α-淀粉酶和蛋白酶,萃取最適宜條件為PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%),pH=8,α-淀粉酶收率為90%,分配系數(shù)為19.6,蛋白酶的分離系數(shù)高達(dá)15.1。蛋白酶在水相中的收率高于60%。第116頁/共170頁117?#?2.提取抗生素和分離生物粒子

采用PEG/Na2HPO4

體系提取丙酰螺旋霉素，最佳萃取條件是pH=8.0～8.5，PEG2000(14%)/Na2HPO4(18%),丙酰螺旋霉素收率達(dá)69.2%。第117頁/共170頁118?#?雙水相和其他方法的集成1、與生物轉(zhuǎn)化的集成；2、與膜分離技術(shù)的集成；3、與溫度誘導(dǎo)相分離的集成；4、與親和萃取的集成；5、與親和沉淀的集成；6、與電泳技術(shù)的集成；7、磁場與雙水相分離；8、超聲波與雙水相分配。第118頁/共170頁119?#?3.7膜分離法

膜分離法實(shí)際上是一般過濾法的發(fā)展和延續(xù)。一般過濾法不是分子級水平的，它是利用相的不同將固體從液體或氣體中分離出來；而膜分離是分子級水平的分離方法，該法關(guān)鍵在于過程中使用的過濾介質(zhì)：膜。

膜必須是半透膜，既能透過某種物質(zhì)，而阻礙另一種物質(zhì)。膜過濾通常在常溫下操作，不含相的變化，這對出來熱敏感的物質(zhì)如食品、制藥等工業(yè)和生物產(chǎn)品尤為重要。第119頁/共170頁120?#?

所謂的膜，是指在一種流體相內(nèi)或是在兩種流體相之間有一層薄的凝聚相，它把流體相分隔為互不相通的兩部分，并能使這兩部分之間產(chǎn)生傳質(zhì)作用。

膜的特性：◆不管膜多薄,它必須有兩個界面。這兩個界面分別與兩側(cè)的流體相接觸◆膜傳質(zhì)有選擇性，它可以使流體相中的一種或幾種物質(zhì)透過，而不允許其它物質(zhì)透過。膜是什么？有何特性？第120頁/共170頁121?#?膜分離過程原理：以選擇性透膜為分離介質(zhì)，通過在膜兩邊施加一個推動力（如濃度差、壓力差或電壓差等）時，使原料側(cè)組分選擇性地透過膜，以達(dá)到分離提純的目的。通常膜原料側(cè)稱為膜上游，透過側(cè)稱為膜下游。膜上游透膜膜下游選擇性透膜第121頁/共170頁122?#?膜分離法的分類及原理

透析、超濾及反滲透、微濾、電滲析、液膜技術(shù)等。1、透析利用具有一定孔徑大小親水膜，高分子溶質(zhì)不能透過，將含有高分子溶質(zhì)和其他小分子溶質(zhì)的溶液（左側(cè)）與純水或緩沖液（右側(cè)）分隔，由于膜兩側(cè)的溶質(zhì)濃度不同，在濃差的作用下，左側(cè)高分子溶液中的小分子溶質(zhì)透向右側(cè)，右側(cè)中的水透向左側(cè)，這就是透析。第122頁/共170頁123?#?2008-4-222、超濾和微濾超濾和微濾都是利用膜的篩分性質(zhì)，以壓差微為推動力，用于截留高分子溶質(zhì)或固體微粒。超濾：處理不含固形成分的料液，它是根據(jù)高分子溶質(zhì)間或高分子與小分子溶質(zhì)之間相對分子質(zhì)量的差別機(jī)械分離的方法.微濾：用于懸浮粒的過濾，主要用于菌體的分離和濃縮。第123頁/共170頁124?#?3、反滲透促使水分子透過的推動力稱為滲透壓。操作壓力：幾十個大氣壓適用于1nm以下小分子的濃縮。4、電滲析利用分子的荷電性質(zhì)分子大小的差別進(jìn)行分離的膜分離法，可用于小分子電解質(zhì)（例如氨基酸、有機(jī)酸）的分離和溶液的脫鹽。第124頁/共170頁125?#?2008-4-223.14結(jié)晶物質(zhì)有結(jié)晶和無定形兩種狀態(tài)，區(qū)別在于，構(gòu)成單位的排列方式是否規(guī)則。結(jié)晶：析出速度慢，溶質(zhì)分子有足夠時間進(jìn)行排列，粒子排列有規(guī)則。無定形固體：析出速度快，粒子排列無規(guī)則-沉淀。利用可溶物質(zhì)的溶解性及其受溫度變化影響不同，使溶質(zhì)以晶體狀態(tài)從溶液中析出的過程。第125頁/共170頁126?#?

結(jié)晶是制備純物質(zhì)的有效方法，具有高度的選擇性。只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過程有良好的選擇性。通過結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會留在母液中，再通過過濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。結(jié)晶過程具有成本低、設(shè)備簡單、操作方便，廣泛應(yīng)用于氨基酸、有機(jī)酸、抗生素、維生素、核酸等產(chǎn)品的精制。第126頁/共170頁127?#?

大多數(shù)物質(zhì)結(jié)晶都是在溶液中進(jìn)行的，所以形成的晶體中常含有一定量的結(jié)晶水。晶體的含水量與晶體蒸汽壓強(qiáng)有關(guān)，當(dāng)晶體蒸汽壓強(qiáng)高于大氣蒸汽壓強(qiáng)時，則風(fēng)化失去結(jié)晶水。

晶體與非晶體的主要區(qū)別在于晶態(tài)物質(zhì)的許多性質(zhì)如光學(xué)和電學(xué)都具有方向性，即在同一方向上具有相同的性質(zhì)，在不同方向上具有相異性（稱為晶體各向相異性）；非晶體則不具此性質(zhì)。晶體是具有一定形狀的固態(tài)物質(zhì)，由許多性質(zhì)相同的粒子（原子、離子和分子）有規(guī)律地排列而成。第127頁/共170頁128?#?1、結(jié)晶過程的基本原理

飽和溶液：當(dāng)溶液的濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的溶解度時，該溶液稱為飽和溶液；

過飽和溶液：溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度時，該溶液稱之為過飽和溶液；

溶解度和溫度有關(guān)，一般物質(zhì)的溶解度都隨溫度的升高而增加。但有少數(shù)例外，紅霉素在水中的溶解7℃時為14.2mg/ml，而在40℃時則降為1.28mg/ml。第128頁/共170頁129?#?C*---小晶體的溶解度；

C---顆粒半徑為r的溶質(zhì)溶解度σ---固體顆粒與溶液間的界面張力；ρ---晶體密度R---氣體常數(shù)；

T---絕對溫度凱爾文公式顆粒大小與溶解度的關(guān)系式溶解度還和溶質(zhì)顆粒的大小有關(guān)，微小顆粒的溶解度要比正常顆粒大。第129頁/共170頁130?#?結(jié)晶過程的實(shí)質(zhì)

結(jié)晶是指溶質(zhì)自動從過飽和溶液中析出，形成新相的過程。這一過程不僅包括溶質(zhì)分子凝聚成固體，還包括這些分子有規(guī)律地排列在一定晶格中，這一過程與表面分子化學(xué)鍵力變化有關(guān)；因此，結(jié)晶過程是一個表面化學(xué)反應(yīng)過程。

因要形成新的表面，就需要對表面張力做功。因此溶質(zhì)濃度達(dá)到飽和濃度時，還不能使晶體析出，當(dāng)濃度超過飽和濃度一定的過飽和程度時，才有晶體析出。第130頁/共170頁131?#?晶體的形成首先形成晶核，由Kelvin公式，微小的晶核與正常晶體相比具有較大的溶解度。實(shí)質(zhì)上，在飽和溶液中，晶核是處于一種形成—溶解—再形成的動態(tài)平衡之中，只有達(dá)到一定的過飽和度以后，晶核才能夠穩(wěn)定存在。這就是為什么溶液濃度必須達(dá)到一定的過飽和程度時才能結(jié)晶的原因。最先析出的微小顆粒是作為以后晶體的中心，微小顆粒稱為晶核。大小通常在幾個納米至幾十微米。第131頁/共170頁132?#?

過飽和度S：過飽和程度通常用過飽和溶液的濃度與飽和濃度之比S來表示。晶體的形成過程：1、過飽和溶液的形成2、晶核的形成3、晶體生長其中，溶液達(dá)到過飽和狀態(tài)是結(jié)晶的前提；過飽和度是結(jié)晶的推動力。第132頁/共170頁133?#?2008-4-22溶解度與溫度的關(guān)系可以用飽和曲線和過飽和曲線表示實(shí)線代表飽和曲線，虛線代表過飽和曲線溫度ABCDE不穩(wěn)區(qū)介穩(wěn)區(qū)穩(wěn)定區(qū)第133頁/共170頁134?#?2008-4-22穩(wěn)定區(qū)(不飽和區(qū))：不會發(fā)生結(jié)晶；不穩(wěn)定區(qū)(過飽和區(qū))：結(jié)晶能自動生成；介穩(wěn)區(qū)：結(jié)晶不能自動進(jìn)行。向處于介穩(wěn)區(qū)的溶液中加入晶體，能誘導(dǎo)結(jié)晶產(chǎn)生，晶體能生長。第134頁/共170頁135?#?結(jié)晶過程1、晶核形成與晶體生長

溶質(zhì)從溶液中結(jié)晶出來，需經(jīng)歷兩個階段，即晶核的生成（成核）和晶體的成長。晶核的形成（1）過飽和溶液的形成結(jié)晶的首要條件是過飽和，制備過飽和溶液一般有四種方法。A、將飽和溶液冷卻B、將部分溶劑蒸發(fā)C、化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶D、鹽析結(jié)晶第135頁/共170頁136?#?1、熱飽和溶液冷卻（等溶劑結(jié)晶）

適用于溶解度隨溫度升高而增加的體系；同時，溶解度隨溫度變化的幅度要適中；先加熱使其溶解，然后冷卻結(jié)晶；

自然冷卻、間壁冷卻（冷卻劑與溶液隔開）、直接接觸冷卻（在溶液中通入冷卻劑）2、部分溶劑蒸發(fā)法（等溫結(jié)晶法） 適用于溶解度隨溫度降低變化不大的體系，或隨溫度升高溶解度降低的體系；加壓、減壓或常壓蒸餾第136頁/共170頁137?#?3、化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶 加入反應(yīng)劑產(chǎn)生新物質(zhì)，當(dāng)該新物質(zhì)的溶解度超過飽和溶解度時，即有晶體析出。其方法的實(shí)質(zhì)是對待結(jié)晶的物質(zhì)進(jìn)行修飾，可以調(diào)節(jié)其溶解特性。如在青霉素醋酸丁酯提取液中，加入乙醇-醋酸鉀，因形成的青霉素鉀鹽難溶于醋酸丁酯而結(jié)晶析出。4、鹽析結(jié)晶

加入能使結(jié)晶溶質(zhì)溶解度降低的物質(zhì)，讓結(jié)晶溶質(zhì)形成過飽和液而結(jié)晶的方法。常用的沉淀劑：固體氯化鈉、甲醇、乙醇、丙酮。例如卡那霉素不溶于乙醇，向卡那霉素脫色液中加入終濃度為60%-80%的乙醇，就結(jié)晶析出;在普魯卡因青霉素結(jié)晶時，加入一定量的食鹽，可使結(jié)晶更易析出。第137頁/共170頁138?#?晶核的形成

晶核的形成是一個新相產(chǎn)生的過程，需要消耗一定的能量才能形成固液界面；結(jié)晶過程中，體系總的自由能變化分為兩部分，即：表面過剩吉布斯自由能（ΔGs）和體積過剩吉布斯自由能（ΔGv）；晶核的形成必須滿足：ΔG=ΔGs+ΔGv<0通常ΔGs>0，阻礙晶核形成；第138頁/共170頁139?#?臨界半徑與成核功假定晶核形狀為球形，半徑為r，則ΔGv=4/3(πr3ΔGv)；若以σ代表液固界面的表面張力，則ΔGs=4πr2σ；因此，在恒溫、恒壓條件下，形成一個半徑為r的晶核，其總吉布斯自由能的變化為：ΔG=4πr2(σ+(r/3)ΔGv)ΔGv—形成單位體積晶體的吉布斯自由能變化第139頁/共170頁140?#?臨界半徑（rc）臨界晶核半徑是指ΔG=4πr2(σ+(r/3)ΔGv)為最大值時的晶核半徑；r<rc

時，ΔGs占優(yōu)勢，故ΔG>0，晶核不能自動形成；r>rc

時，ΔGv占優(yōu)勢，故ΔG<0，晶核可以自動形成，并可以穩(wěn)定生長；rc

稱為臨界半徑。r<rc晶體自動溶解；r＞rc晶體自動生長。第140頁/共170頁141?#?晶核的成核速度成核速度：單位時間內(nèi)在單位體積溶液中生成新核的數(shù)目。成核速度大：導(dǎo)致細(xì)小晶體生成，因此，需要避免過量晶核的產(chǎn)生。影響成核速度的因素：1、過飽和度當(dāng)過飽和度超過某一值時，成核速度增加很快。2、黏度黏度大時，分子運(yùn)動減慢，成核速度降低。第141頁/共170頁142?#?3、溫度

一般成核速度隨溫度上升，達(dá)到