基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)第1頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四生物芯片是八十年代末在生命科學領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術(shù)，它主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。第2頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四世界著名商業(yè)雜志《財富》對基因生物芯片領(lǐng)域非?？春?，它在其1997年的3月31刊中講到：“微處理器使我們的經(jīng)濟發(fā)生了根本改變、給人類帶來了巨大的財富、改變了我們的生活方式。然而，生物芯片給人類帶來的影響可能會更大…...”第3頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四酵母全基因組基因芯片第4頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)生物芯片簡介1.1生物芯片的定義

生物芯片是指通過機器人自動印跡或光引導化學合成技術(shù)在硅片、玻璃、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微陣列，根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將生命科學領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于芯片表面，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。第5頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片——又稱DNA芯片或DNA陣列，是生物芯片的一種類型，它是將DNA分子固定于支持物上，并與標記的樣品雜交，通過自動化儀器檢測雜交信號的強度來判斷樣品中靶分子的數(shù)量，進而得知樣品中mRNA的表達量，也可以進行基因突變體的檢測和基因序列的測定。第6頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四1.2基因芯片分析流程

基因芯片分析的過程主要包括樣品及其標記處理、芯片制作、分子雜交、信號的檢測和數(shù)據(jù)處理及分析等幾個步驟?；蛐酒睦碚摶A(chǔ)：傳統(tǒng)的Southernblot和Northernblot是將受檢測的樣本固定在尼龍膜上，再利用特定的已知探針來檢測樣本中是否存在互補的DNA序列?；蛐酒暮诵脑砼cSouthernblot和Northernblot相同，只是相反將各種探針固化到基質(zhì)上，用以檢測受檢樣品中與各種探針互補的核酸物質(zhì)的變化。第7頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四第8頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四1樣品制備2DNA提取3熒光標記4分子雜交5信號檢測6點陣分析第9頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四1.3基因芯片技術(shù)的特點1、基因芯片的優(yōu)點1）高通量性：可同時并行分析成千上萬種分子。節(jié)省時間，并減少系統(tǒng)誤差。2）微型化3）高度自動化4）結(jié)果重現(xiàn)性和準確性更高（基因芯片能在同一張芯片上同時對實驗組和對照組材料進行雜交分析，這樣就實現(xiàn)了平行化操作，避免了各種誤差，使實驗結(jié)果具有可比性）第10頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四2、基因芯片的缺點

基因芯片技術(shù)體系的建立和使用需要較大的投入。（但是，相對于傳統(tǒng)的表達分析技術(shù)而言，單個基因分析的成本仍是較低的。）第11頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)生物芯片的分類2.1按載體材料分類

玻璃芯片硅芯片陶瓷芯片

玻璃芯片具有易得、熒光背景低、應(yīng)用方便等優(yōu)點，目前在國際上廣泛使用。

第13頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四2.2按點樣方式分類1、原位合成芯片（將半導體中的光蝕刻技術(shù)運用到DNA合成化學中，以單核苷酸或其他分子大分子為底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸）2、微矩陣芯片（目前應(yīng)用最廣泛的基因芯片之一。具有高密度、制作簡便的特點。其是將用PCR或化學合成等方法得到的DNA或寡核苷酸片段用針點或噴點的方法直接排列到玻片等載體上，從而制備成芯片。）3、電定位芯片（利用靜電吸附的原理將DNA快速定位在硅基質(zhì)、導電玻璃上。）第14頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四2.3按芯片固定的生物分子類型分類（1）基因芯片或DNA芯片（2）蛋白質(zhì)芯片（3）芯片實驗室（lab-on-chip）

將一個實驗的各個步驟微縮于一個芯片上芯片實驗室（Lab-on-a-chip）或稱微全分析系統(tǒng)（MiniaturizedTotalAnalysisSystem,μ-TAS）是指把生物和化學等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、生物與化學反應(yīng)、分離檢測等基本操作單位集成或基本集成一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學反應(yīng)過程，并對其產(chǎn)物進行分析的一種技術(shù)。第15頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四芯片實驗室的特點:其一、集成性。目前一個重要的趨勢是：集成的單元部件越來越多，且集成的規(guī)模也越來越大。所涉及到的部件包括：和進樣及樣品處理有關(guān)的透析、膜、固相萃取、凈化；用于流體控制的微閥（包括主動閥和被動閥），微泵（包括機械泵和非機械泵）；微混合器，微反應(yīng)器，另外還有微通道和微檢測器等。

其二、分析速度極快。Mathies研究小組在一個半徑僅為8厘米長的園盤上集成了384個通道的電泳芯片。他們在325秒內(nèi)檢測了384份與血色病連鎖的H63D突變株（在人HFE基因上）樣品，每個樣品分析時間不到一秒鐘。

其三、高通量。

其四、能耗低，物耗少，污染小。每個分析樣品所消耗的試劑僅幾微升至幾十個微升，被分析的物質(zhì)的體積只需納升級或皮升級。其五、廉價，安全。無論是化學反應(yīng)芯片還是分析芯片由于上述特點隨著技術(shù)上的成熟，其價格將會越來越廉價。針對化學反應(yīng)芯片而言，由于化學反應(yīng)在微小的空間中進行，反應(yīng)體積小，分子數(shù)量少，反應(yīng)產(chǎn)熱少，又因反應(yīng)空間體表面積大，傳質(zhì)和傳熱的過程很快，所以比常規(guī)化學反應(yīng)更安全。第16頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四2.4按芯片使用功能分類

（1）測序芯片（2）表達譜芯片（3）基因差異表達分析芯片第17頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四一組寡核苷酸探針—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定的一組核酸探針序列GTTAGATC雜交探針組TATGCAATCTAG重組的互補序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC

ATACGTTA測序芯片第18頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四基因表達譜芯片第19頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四基因差異表達分析芯片第20頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)基因芯片的制作固相介質(zhì)

硅片、二氧化硅、玻璃、尼龍膜、塑料等。靶片段

DNA、寡核苷酸、RNA等。探針

mRNA，或是以mRNA為模板合成的cDNA。標記物常采用熒光劑（如Cy3、Cy5）；同位素等。第21頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四3.1用于芯片制作的DNA樣品的來源

（1）從細胞或組織中提取mRNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫，經(jīng)測序及生物信息學分析得到代表各個基因的DNA序列，用PCR擴增技術(shù)或DNA固相結(jié)合技術(shù)來獲取人們所期望的各種基因片段；（2）利用基因組測序數(shù)據(jù)，經(jīng)生物信息學分析得到代表各個基因的數(shù)據(jù)，在利用PCR技術(shù)或DNA固相結(jié)合技術(shù)來獲取人們所期望的各種基因片段。第22頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四3.2生物芯片的制作方法

生物芯片微陣列的制作技術(shù)按照制作方法可分為：原位合成和預(yù)合成后點樣。

原位合成法是由點樣系統(tǒng)將探針的組成部分逐步轉(zhuǎn)移到基體上，同時實現(xiàn)探針合成和轉(zhuǎn)移的目的。

預(yù)合成后點樣是指制備芯片微陣列前，要固定的探針已經(jīng)合成好，點樣系統(tǒng)需要做的就是把這些合成好的樣品涂印或噴涂在基體上。第23頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四1、原位合成光刻DNA合成法（將半導體工業(yè)中的光刻技術(shù)和DNA化學合成相結(jié)合，把光不穩(wěn)定保護基團保護的4種DNA模塊固定在玻片上，通過光脫保護，用少量的保護寡核苷酸和試劑按照設(shè)計的序列進行DNA合成。）

優(yōu)點：合成的密度和精度優(yōu)于后兩種方法。

缺點：需要花費大量的時間去設(shè)計和制造價格很高的照相掩蔽網(wǎng)。第24頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四1通過光刻掩膜曝光2去保護區(qū)域被激活3固相化合成1個堿基4通過另一個光刻掩膜曝光5引入另一個堿基6重復(fù)這一步驟第25頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四2、預(yù)合成后點樣（1）接觸點樣法（將樣品直接點在基體上）

優(yōu)點：儀器結(jié)構(gòu)簡單、容易研制，是一種快速、經(jīng)濟、多功能的儀器。

缺點：每個樣品都必須是合成好、經(jīng)過純化、事先保存的。第26頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四2202芯片點樣儀

生產(chǎn)商Bio-Rad

性能介紹分辨率：1.25um(x，y軸)和0.25um(Z軸)，重復(fù)性：3um

球面精確性：l0um。

一次制成芯片數(shù)：126塊芯片每塊玻片點樣量>82,000個點

第27頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四第28頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四（2）噴墨法（通過壓電晶體或其他推進式從很小的噴嘴內(nèi)把生物樣品噴射到玻璃載體上。）該法所需的樣品都必須是合成好的純樣品（cDNA、染色體DNA和抗體）。與接觸點樣法不同之處在于噴嘴不與芯片接觸。第29頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四點樣法首先按常規(guī)方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫，然后通過特殊的針頭和微噴頭,分別把不同的探針溶液，逐點分配在玻璃、尼龍或者其它固相基底表面上不同位點,并通過物理和化學的結(jié)合使探針被固定于芯片的相應(yīng)位點。玻璃基質(zhì)第30頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片微點陣制備系統(tǒng)第31頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四3.3DNA分子在剛性表面的固定制作生物芯片的載體材料必須符合下列要求：（1）載體表面必須適應(yīng)透射或反射光的測量；（2）使單位載體上結(jié)合的生物分子達到最佳容量；（3）載體應(yīng)當是惰性的和有足夠的穩(wěn)定性。第32頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片制作的關(guān)鍵就是如何將大量的探針分子固定于支持物上，并保持探針分子的構(gòu)像處于自然狀態(tài)，使探針DNA分子能自由地與樣品分子進行雜交。第33頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四第34頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四第35頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四第四節(jié)基因芯片的雜交及結(jié)果分析4.1探針的標記

標記的方法通常是在反轉(zhuǎn)錄的底物中加入帶有標記基團的寡核苷酸單體，通過反轉(zhuǎn)錄將標記分子滲入cDNA分子中。

mRNA反轉(zhuǎn)錄標記方法直接影響DNA芯片分析結(jié)果的準確性及重現(xiàn)性。第36頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四第37頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四第38頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四第39頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四4.2雜交

在一定條件下，分子間氫鍵的斷裂與恢復(fù)是DNA/DNA、DNA/RNA分子間選擇性結(jié)合的根本動力，這一過程稱之為雜交。

第40頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：雜交時間短，30分鐘內(nèi)完成可同時平行檢測許多基因序列影響雜交反應(yīng)的因素：靶分子濃度、探針濃度、靶分子和探針的序列組成、鹽濃度及雜交溫度和時間等。第41頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四4.3芯片結(jié)果讀取與掃描儀生物芯片的掃讀（掃描）是指將與目的DNA（或RNA）雜交后、或與目的抗原、抗體、或受體等目的靶分子反應(yīng)結(jié)合后的生物芯片上成千上萬個點陣的生物反應(yīng)結(jié)果閱讀出來，轉(zhuǎn)變成為可供計算機處理的數(shù)據(jù)。熒光標記的生物芯片掃描儀按其原理與結(jié)構(gòu)可以分為激光系統(tǒng)掃描儀和CCD系統(tǒng)掃描儀。第42頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片雜交結(jié)果要用專用的掃描系統(tǒng)讀取。BBACDE放大器數(shù)模轉(zhuǎn)換器計算機A:激光器B:濾光片C:二色鏡D:反光鏡E:關(guān)柵

第43頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片掃描結(jié)果不同的顏色代表一個探針點雜交上的帶熒光標記的核酸分子數(shù)的差異。紅〉黃〉綠〉蘭〉紫第44頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四基因芯片熒光偵測儀

高密度微點陣檢測掃描系統(tǒng)第45頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四高密度微點陣分析軟件

圖象分析系統(tǒng)第46頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四4.4生物芯片的軟件系統(tǒng)與數(shù)據(jù)處理

當從芯片發(fā)出的熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)字輸出后，數(shù)據(jù)文件就被定量和翻譯，通過重疊芯片像線柵，軟件對芯片上的每個點計算平均密度值，從而完成定量，通過對芯片上實驗點和對照點的比較，選出雜交點，并定量。第47頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四

一個完整的生物芯片配套軟件應(yīng)該包括生物芯片掃描儀的硬件控制軟件、生物芯片的圖像處理軟件和數(shù)據(jù)提取或統(tǒng)計分析軟件，以及芯片表達基因的國際互聯(lián)網(wǎng)上檢索和表達基因數(shù)據(jù)庫分析和積累。第48頁，共53頁，2023年，2月20日，星期四第五節(jié)基因芯片的應(yīng)用1、基因表達分析2、基因型及多態(tài)性分析3、雜交測序4、核酸和蛋白質(zhì)相互作用的研究5、疾病的診斷與治療6、藥物開發(fā)7、在營養(yǎng)與食品衛(wèi)生領(lǐng)域