基因工程原理 動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移

動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移

1現(xiàn)在是1頁\一共有41頁\編輯于星期三Introduction動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移已應(yīng)用了40多年研究基因功能和調(diào)控或者生產(chǎn)大量的重組蛋白哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)體內(nèi)基因治療不同于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物2現(xiàn)在是2頁\一共有41頁\編輯于星期三動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的策略直接DNA轉(zhuǎn)移

顯微注射，基因槍轉(zhuǎn)染技術(shù)

利用化學(xué)和物理技術(shù)誘導(dǎo)細(xì)胞從外界環(huán)境攝取DNA病毒介導(dǎo)——轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)菌介導(dǎo)——細(xì)菌感染3現(xiàn)在是3頁\一共有41頁\編輯于星期三轉(zhuǎn)染技術(shù)化學(xué)方法

（不同的方法有相似的原理）DNA/磷酸鈣共沉淀法

其他化學(xué)方法

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染物理方法

（有多樣的機(jī)制）

電穿孔，顯微注射，基因槍4現(xiàn)在是4頁\一共有41頁\編輯于星期三DNA/磷酸鈣共沉淀法HPRT缺陷型的細(xì)胞DNA/磷酸鈣共沉淀為復(fù)合物，積累到細(xì)胞膜上，然后再由細(xì)胞攝取到內(nèi)部，并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，DNA釋放并得到表達(dá)沉淀物要現(xiàn)用現(xiàn)配沉淀物必須包裹細(xì)胞，只適用于單層生長的細(xì)胞，而不適用懸浮或成團(tuán)生長的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低5現(xiàn)在是5頁\一共有41頁\編輯于星期三6現(xiàn)在是6頁\一共有41頁\編輯于星期三其他的化學(xué)轉(zhuǎn)染方法二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)

可溶性聚陽離子糖類，可以促進(jìn)DNA與胞吞相互作用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率很高，但不能形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系7現(xiàn)在是7頁\一共有41頁\編輯于星期三脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Lipofection(liposometransfection)將DNA包裝到一個(gè)磷脂泡囊中，泡囊可以與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜相互作用，促進(jìn)DNA攝取。適用于多種細(xì)胞類型，包括懸浮細(xì)胞可以轉(zhuǎn)染大片段DNA，比較溫和轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%可用于基因治療8現(xiàn)在是8頁\一共有41頁\編輯于星期三Lipofection9現(xiàn)在是9頁\一共有41頁\編輯于星期三10現(xiàn)在是10頁\一共有41頁\編輯于星期三電穿孔法細(xì)胞置于短暫的電脈沖中使細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)的納米大小的孔，DNA通過這些孔進(jìn)入細(xì)胞并轉(zhuǎn)運(yùn)到核。適用于多種類型的細(xì)胞確定電脈沖的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間參數(shù)確定后，具有高重復(fù)性需要的細(xì)胞量比較大，容易引起死亡11現(xiàn)在是11頁\一共有41頁\編輯于星期三單細(xì)胞轉(zhuǎn)染新技術(shù)：納米鋼筆探針電穿孔12現(xiàn)在是12頁\一共有41頁\編輯于星期三直接轉(zhuǎn)化的方法顯微注射13現(xiàn)在是13頁\一共有41頁\編輯于星期三基因槍14現(xiàn)在是14頁\一共有41頁\編輯于星期三瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)入的DNA不能被細(xì)胞所整合，DNA在核中保持外源染色體狀態(tài)，也不包含在宿主細(xì)胞中可以發(fā)揮功能的復(fù)制起始位點(diǎn)，那么它只能保留很短的時(shí)間就會(huì)稀釋或者降解。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：DNA整合到基因組中，形成新的遺傳位點(diǎn)，并遺傳給所有的無性繁殖后代。15現(xiàn)在是15頁\一共有41頁\編輯于星期三共轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的篩選動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)記內(nèi)源選擇標(biāo)記（依賴突變體）共轉(zhuǎn)染顯性選擇標(biāo)記16現(xiàn)在是16頁\一共有41頁\編輯于星期三TK可用作內(nèi)源選擇標(biāo)記17現(xiàn)在是17頁\一共有41頁\編輯于星期三常用的內(nèi)源選擇標(biāo)記基因現(xiàn)在是18頁\一共有41頁\編輯于星期三共轉(zhuǎn)染物理上不相連的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，都會(huì)整合到基因組中。利用了解清楚的質(zhì)粒與目的基因共轉(zhuǎn)染，已知的篩選標(biāo)記篩選，Southern鑒定目的基因。不相連的供體DNA片段在整合之前發(fā)生了融合。19現(xiàn)在是19頁\一共有41頁\編輯于星期三顯性選擇標(biāo)記內(nèi)源標(biāo)記的缺陷：只能用于那些對(duì)應(yīng)基因不具有功能的突變細(xì)胞系。顯性選擇標(biāo)記所提供的表現(xiàn)型對(duì)于細(xì)胞來說是全新的，因此可以用于任何類型的細(xì)胞。20現(xiàn)在是20頁\一共有41頁\編輯于星期三21現(xiàn)在是21頁\一共有41頁\編輯于星期三選擇標(biāo)記和轉(zhuǎn)化基因的擴(kuò)增添加藥物篩選后，少數(shù)個(gè)別細(xì)胞會(huì)自發(fā)產(chǎn)生抗藥性突變而存活氨甲喋呤，DHFR，dhfr“假陽性”的去除：強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)dhfr，引入第二個(gè)選擇標(biāo)記22現(xiàn)在是22頁\一共有41頁\編輯于星期三DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體23現(xiàn)在是23頁\一共有41頁\編輯于星期三質(zhì)粒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染的優(yōu)點(diǎn)質(zhì)粒載體的方便性得以在動(dòng)物細(xì)胞中應(yīng)用質(zhì)粒上的調(diào)控序列可以驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá)質(zhì)粒上的選擇標(biāo)記和目的基因會(huì)一起整合到基因組，不需要與其他基因共轉(zhuǎn)染穿梭載體的使用，使載體保持為游離的復(fù)制子24現(xiàn)在是24頁\一共有41頁\編輯于星期三用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的非復(fù)制型質(zhì)粒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化時(shí)經(jīng)常使用質(zhì)粒載體目的就是利用染色體外DNA的短期存在性基因表達(dá)的瞬時(shí)測(cè)定和重組蛋白的適量回收在大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞中共價(jià)閉合環(huán)狀DNA只能保持1~2天。25現(xiàn)在是25頁\一共有41頁\編輯于星期三復(fù)制子載體的轉(zhuǎn)染失控的多瘤病毒復(fù)制子BK和BPV復(fù)制子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化EBV復(fù)制子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化26現(xiàn)在是26頁\一共有41頁\編輯于星期三失控的多瘤病毒復(fù)制子多瘤病毒會(huì)造成溶解感染，即病毒基因組復(fù)制出非常高的拷貝數(shù)，從而使細(xì)胞裂解，釋放出成千上萬的子代病毒顆粒。利用其復(fù)制起點(diǎn)和啟動(dòng)子構(gòu)建克隆載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，大量生產(chǎn)重組蛋白27現(xiàn)在是27頁\一共有41頁\編輯于星期三SV40病毒載體SV40有約5kb的環(huán)狀雙鏈DNA基因組最初的SV40載體是病毒載體病毒外殼最大只能插入2.5kb的外源DNA28現(xiàn)在是28頁\一共有41頁\編輯于星期三SV40質(zhì)粒載體攜帶有SV40復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒與病毒本身具有同樣的作用將SV40復(fù)制起點(diǎn)克隆到大腸桿菌載體上T抗原編碼區(qū)整合鼠多瘤病毒復(fù)制起始位點(diǎn)人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子29現(xiàn)在是29頁\一共有41頁\編輯于星期三BK和BPV復(fù)制子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BK病毒和EBV病毒會(huì)導(dǎo)致潛伏性感染，病毒基因組保持在低或中等的拷貝數(shù)，從而不會(huì)影響宿主細(xì)胞的生長。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率等于普通瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的效率提供BKT抗原后，含有BK復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒載體就會(huì)像病毒一樣進(jìn)行復(fù)制引入neo等選擇標(biāo)記后，逐步提高培養(yǎng)基中抗生素的濃度，就可以篩選高拷貝的細(xì)胞30現(xiàn)在是30頁\一共有41頁\編輯于星期三31現(xiàn)在是31頁\一共有41頁\編輯于星期三BPV載體32現(xiàn)在是32頁\一共有41頁\編輯于星期三EBP載體33現(xiàn)在是33頁\一共有41頁\編輯于星期三腺病毒DNA病毒，基因組大約36kb6個(gè)早期轉(zhuǎn)錄子，1個(gè)主要的后期轉(zhuǎn)錄子穩(wěn)定性、外源DNA高容量、宿主范圍廣、高滴度后代34現(xiàn)在是34頁\一共有41頁\編輯于星期三腺病毒相關(guān)載體AAV單鏈DNA病毒對(duì)異源輔助病毒有依賴性AAV載體已用于將基因高效轉(zhuǎn)入許多類型的細(xì)胞35現(xiàn)在是35頁\一共有41頁\編輯于星期三桿狀病毒桿狀病毒具有桿狀的衣殼和大的dsDNA基因組感染許多節(jié)肢動(dòng)物，特別是昆蟲。主要用于在昆蟲和昆蟲細(xì)胞內(nèi)的高水平瞬時(shí)蛋白表達(dá)AcMNPV和BmNPVsf9，sf21家蠶活體36現(xiàn)在是36頁\一共有41頁\編輯于星期三37現(xiàn)在是37頁\一共有41頁\編輯于星期三38現(xiàn)在是38頁\一共