實驗三SDSPAGE測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量

實驗三SDSPAGE測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量第1頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四一、實驗?zāi)康亩?、實驗原理三、實驗步驟本節(jié)課的內(nèi)容第2頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的原理。掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)。第3頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四二、實驗原理電泳的基本知識和原理SDS的性質(zhì)與作用聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)第4頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四什么是電泳？

電泳（electrophoresis）是指帶電顆粒在電場中的泳動。許多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都含有可電離基團(tuán)，在非等電點條件下帶有電荷，在電場力的作用下，它們向著與其所帶電荷相反的電極移動。電泳技術(shù)就是利用樣品中各種分子帶電性質(zhì)、分子大小、形狀等的差異，在電場中的遷移速度不同，從而對樣品進(jìn)行分離、純化和鑒定的一種綜合技術(shù)?？捎糜跇悠返闹苽?、純度鑒定、分子量測定等。電泳的基本知識和原理第5頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四影響帶電粒子在電場中泳動的因素1．生物大分子的性質(zhì)：待分離生物大分子所帶電荷的多少、分子大小和性質(zhì)都會對電泳產(chǎn)生明顯影響。2．緩沖液：緩沖液pH值直接影響生物大分子的解離程度和帶電性質(zhì).溶液pH值距離等電點愈遠(yuǎn)，生物大分子所帶凈電荷就越多，電泳時速度就越快。當(dāng)緩沖液pH大于等電點時，生物大分子帶負(fù)電荷，電泳時向正極移動；當(dāng)緩沖液pH小于等電點時，生物大分子帶正電荷，電泳時向負(fù)極移動。電泳的基本知識和原理第6頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四3．電場強度：

電場強度指每單位介質(zhì)長度的電位梯度（又稱電位差或電位降）。一般而言，電場強度越大，電泳速度越快。但隨著電場強度的增大會引起通過介質(zhì)的電流強度增大，從而造成電泳過程產(chǎn)生的熱量增多，最終導(dǎo)致介質(zhì)溫度升高。降低電流強度，可以減少產(chǎn)熱，但會延長電泳時間，引起生物大分子擴(kuò)散增加，同樣影響分離效果。所以電泳實驗中要選擇適當(dāng)?shù)碾妶鰪姸?。電泳的基本知識和原理第7頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四4．電滲：

液體在電場中對于固體支持介質(zhì)的相對移動稱為電滲。由于支持介質(zhì)表面存在一些帶電基團(tuán)，如濾紙表面含有羧基，瓊脂含有硫酸基等。這些基團(tuán)電離后使支持介質(zhì)表面帶電，吸附一些帶相反電荷的離子在電場作用下向電極方向移動，形成介質(zhì)表面溶液的流動。當(dāng)電滲方向與電泳方向相同時則加快電泳速度；當(dāng)電滲方向與電泳方向相反時，則降低電泳速度。電泳的基本知識和原理第8頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四5．支持介質(zhì)的篩孔：支持介質(zhì)的篩孔大小對生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質(zhì)中泳動速度快，反之則泳動速度慢。電泳的基本知識和原理第9頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四電泳技術(shù)的分類1.根據(jù)電泳中是否使用支持介質(zhì)分為自由電泳和區(qū)帶電泳：①自由電泳不使用支持介質(zhì)，電泳在溶液中進(jìn)行。②區(qū)帶電泳需使用支持介質(zhì)，根據(jù)支持介質(zhì)不同可分為醋酸纖維薄膜電泳、薄層電泳和凝膠電泳等。根據(jù)支持介質(zhì)的裝置形式不同又可分為水平板式電泳、垂直板式電泳、垂直盤狀電泳、毛細(xì)管電脈等。2.根據(jù)電泳時電壓的高低分為高壓電泳和常壓電泳：①高壓電泳使用的電壓在500～1000V，這類電泳分離速度快，但熱效應(yīng)較大，必須具備冷卻裝置，主要適用于小分子化合物的快速分離。②常壓電泳使用的電壓在500V以下，電位梯度為2～10V/cm。這類電泳的分離速度較慢，但對電泳設(shè)備要求簡單。電泳的基本知識和原理第10頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四3．根據(jù)電泳系統(tǒng)pH是否連續(xù)分為連續(xù)pＨ電泳和不連續(xù)pＨ電泳：①連續(xù)pH電泳是指電泳全過程中pH保持不變，②不連續(xù)pH電泳是指電極緩沖液和電泳支持介質(zhì)中的pH不同，甚至電泳支持介質(zhì)不同區(qū)段的pH也不相同，如聚丙烯酰胺凝膠電泳。4．根據(jù)工作目的和分離樣品的數(shù)量多少分為分析電泳和制備電泳。5．根據(jù)結(jié)合配套的技術(shù)種類不同分為免疫電泳、層析電泳、等電聚焦電泳、轉(zhuǎn)移電泳、雙相電泳、脈沖梯度電場凝膠電泳和相互垂直交替電場凝膠電泳等。6．根據(jù)電泳物質(zhì)類別不同分為細(xì)胞電泳、核酸電泳、蛋白質(zhì)電泳等

電泳的基本知識和原理第11頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四電泳示蹤劑電泳常用的示蹤劑有溴酚蘭和二甲苯青FF。示蹤劑一般與蔗糖、甘油組成上樣緩沖液，蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增加，以確保樣品均勻沉入加樣孔內(nèi)。電泳的基本知識和原理第12頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四十二烷基磺酸鈉(SDS)

Sodiumdodecylsulphate

CH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+

SDS的性質(zhì)與作用SDS是一種陰離子型去污劑，SDS能使蛋白質(zhì)的非共價鍵（氫鍵、疏水鍵）打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物。第13頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四

蛋白質(zhì)變性0.1-1%SDS0.1Mbeta-巰基乙醇蛋白質(zhì)變與SDS分子按比例結(jié)合1：1.4SDSSDS的性質(zhì)與作用SDS的結(jié)構(gòu)決定了它可破壞蛋白質(zhì)的疏水作用（該作用對維持蛋白三級和四級結(jié)構(gòu)相當(dāng)重要），SDS：十二烷基磺酸鈉，十二烷基部分是疏水結(jié)構(gòu)，而磺酸鈉部分是親水或極性結(jié)構(gòu)。SDS的疏水結(jié)構(gòu)可插入蛋白質(zhì)的疏水內(nèi)部（通常水溶性的蛋白質(zhì)，其疏水氨基酸殘基埋藏在蛋白內(nèi)部，親水氨基酸殘基位于分子表面），這樣，SDS就破壞了蛋白的疏水作用，從而破壞蛋白的三級或四級結(jié)構(gòu)，引起變性。beta-巰基乙醇第14頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物分子構(gòu)型也幾乎相同(雪茄煙形的長橢圓棒狀的復(fù)合物)，而且具有相同的荷質(zhì)比，因此在SDS中，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳遷移率只與其分子量有關(guān)，而不再受所帶電荷及分子形狀的影響，且在一定條件下，遷移率與分子量呈對數(shù)線性關(guān)系

SDS的性質(zhì)與作用第15頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，具有機(jī)械強度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、無電滲作用、設(shè)備簡單、樣品量?。?～100μg）、分辨率高等優(yōu)點，并可通過控制單體濃度或與交聯(lián)劑的比例聚合成不同大小孔徑的凝膠?？捎糜诘鞍踪|(zhì)、核酸等分子大小不同的物質(zhì)的分離、定性和定量分析；還可結(jié)合解離劑十二烷基硫酸鈉（SDS）以測定蛋白質(zhì)亞基的相對分子質(zhì)量。聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)第16頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四聚丙烯酰胺凝膠性質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠(PAG)是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑的作用下，聚合交聯(lián)而成的。聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)第17頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四聚丙烯酰胺凝膠的聚合體系有兩種：（1）化學(xué)聚合：通常采用過硫酸銨(AP)為催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在TEMED催化下，過硫酸銨可使丙烯酰胺單體的雙鍵打開、活化形成自由基丙烯酰胺，從而引發(fā)聚合作用。（2）光聚合：通常采用核黃素作催化劑，核黃素在光照下光解成無色基，后者再被氧化成自由基而引發(fā)聚合作用。光聚合的凝膠孔徑較大，而且隨時間延長而逐漸變小，不太穩(wěn)定。化學(xué)聚合的凝膠孔徑較小，且各次制備的重復(fù)性好。故一般采用化學(xué)聚合。聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)第18頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳有三種效應(yīng)：濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。濃縮效應(yīng)在濃縮膠中進(jìn)行；電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)在分離膠中進(jìn)行。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。聚丙烯酰胺凝膠的性質(zhì)第19頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四三、實驗步驟一、安裝垂直板型電泳裝置二、凝膠的制備

第20頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四分離膠的制備在一個干凈的小燒杯中，按所列的試劑用量配制。

SDS-不連續(xù)系統(tǒng)12％分離膠濃度，10ml體積配制量：1.30%凝膠貯液4.0ml2.分離膠緩沖液1.25ml3.10%SDS0.1ml4.ddH2O4.0ml5.10%過硫酸胺0.06ml6.2%TEMED0.6ml第21頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四加入分離膠溶液pH8.8封水或飽和乙醇溶液出現(xiàn)明顯界面時，分離膠凝聚完成（３０min~１h）倒出水或乙醇，并用濾紙吸干制備分離膠封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。第22頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四濃縮膠的制備在另一個干凈的小燒杯中。

4.5％分離膠濃度，5ml體積配制用量表：1.30%凝膠貯液0.75mL2.濃縮膠緩沖液0.83mL3.10%SDS

0.1ml4.ddH2O3.0mL10%過硫酸胺0.03mL2%TEMED

0.3mL第23頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四分離膠pH8.8加入濃縮膠溶液pH6.8制備濃縮膠樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。插入樣品梳第24頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四濃縮膠對蛋白樣品具有壓縮堆積作用。凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選pH6.8的TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。大大提高了電泳的靈敏度。濃縮膠的工作原理：第25頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四牛血清白蛋白樣品2樣品1蛋白marker樣品1樣品2牛血清白蛋白兩塊膠一個電泳系統(tǒng)，兩組共用：第一組加樣第二組加樣第二塊膠加樣順序與第一塊膠相同第26頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四三加樣

將pH8.3的電極緩沖溶液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒過短玻璃片。用微量注射器依次在各個樣品凹槽內(nèi)加樣，一般加樣體積為10～15μL。如樣品較稀，可加20～30μL。由于樣品溶解液中含有比重較大的甘油，故樣品溶液會自動沉降在凝膠表面形成樣品層。第27頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四四電泳

將上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開電源，開始時將電流控制在15～20mA,待樣品進(jìn)入分離膠后，改為30～50mA。待藍(lán)色染料遷移至下端約1～1.5cm時，停止電泳，約需1～2小時。恒壓(60V90V)

第28頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四1.加入電極緩沖液pH8.3濃縮膠pH6.83.通電分離膠pH8.82加入樣品上樣及電泳開始電流恒定在10mA，當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為20mA，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。第29頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四五剝膠

取下凝膠模子，將凝膠片取出，滑入一白瓷盤或大培養(yǎng)皿內(nèi)。第30頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四六染色和脫色

染色用一塊膠，另一塊膠用于轉(zhuǎn)膜。加入染色液，染色45分鐘。脫色

染色完畢，傾出染色液，加入脫色液。20～30min換一次脫色液，2～3次后可初步觀察電泳條帶，然后脫色過夜，直至背景清晰。第31頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四七、Mr的計算

標(biāo)難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。

以每個蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對數(shù)對它的相對遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量。

第32頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四八轉(zhuǎn)膜膠放在3張緩沖液浸濕的