普通光學(xué)顯微鏡的使用單染色及革蘭氏染色教案

本文格式為Word版，下載可任意編輯——普通光學(xué)顯微鏡的使用，單染色及革蘭氏染色教案山東大學(xué)試驗(yàn)報(bào)告2023年10月10日

姓名班級(jí)13級(jí)生命基地班學(xué)號(hào)同組者：科目微生物學(xué)試驗(yàn)題目普通光學(xué)顯微鏡的使用，單染色及革蘭氏染色組別3

普通光學(xué)顯微鏡的使用，單染色及革蘭氏染色

1.學(xué)習(xí)并把握顯微鏡的結(jié)構(gòu)功能和使用。2.學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)。3.學(xué)習(xí)把握革蘭氏染色法。4.初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的顯微形態(tài)。1、菌種：

金黃色葡萄球菌（G+）、大腸桿菌（G-）、枯草芽孢桿菌以及自選菌種兩種

2、溶液和試劑：

a)草酸銨結(jié)晶紫染液、番紅復(fù)染液等各種染料以及碘液、95%乙醇、無(wú)菌水等b)香柏油、二甲苯3、儀器及其它用品：

普通光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、綢布、酒精燈、載玻片、接種針、培養(yǎng)皿等

A、普通顯微鏡的基本原理1、基本原理

現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來(lái)昂達(dá)成像，故又稱為復(fù)式顯微鏡。它們包括機(jī)械部分和光學(xué)部分兩部分。機(jī)械部分包括鏡座、鏡臂、鏡筒、載物臺(tái)、物鏡轉(zhuǎn)換器、粗調(diào)理螺旋、細(xì)調(diào)理螺旋、標(biāo)本夾等。光學(xué)部分包括接目鏡、接物鏡、

反光鏡、光圈（虹采）、聚光鏡（集光器）等。

顯微鏡的放大效能（分辯率）是由所用光波長(zhǎng)短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定，縮短使用的光波波長(zhǎng)或增加數(shù)值口徑可以提高分辯率，可見(jiàn)光的光波

幅度比較窄，紫外光波長(zhǎng)短可以提高分辯率，但不能用肉眼直接觀測(cè)。所以利用減小光波長(zhǎng)來(lái)提高光學(xué)顯微鏡分辯率是有限的，提高數(shù)值口徑是提高分辯率的理想措施。要增加數(shù)值口徑，可以提高介質(zhì)折射率，當(dāng)空氣為介質(zhì)時(shí)折射率為1，而香柏油的折射率為1.51，和載片玻璃的折射率（1.52）相近，這樣光線可以不發(fā)生折射而直接通過(guò)載片、香柏油進(jìn)入物鏡，

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從而提高分辯率。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辯率越高。

2、油鏡微生物學(xué)使用的顯微鏡的物鏡尋常有低倍鏡（10×）、高倍鏡（40×）和油鏡（100×），油鏡是三者中放大倍數(shù)最大的，油鏡的焦距和工作距離最短，油鏡與其他物鏡不同的是載玻片與物鏡之間隔的不是一層空氣（枯燥系），而是一層油脂，稱為“油浸系〞。由于香柏油與玻璃的折光率相像（香柏油為1.515，玻璃為1.52）。鏡檢時(shí)，滴加香柏油的作用是使光源盡可能多的進(jìn)入物鏡中，避免光線通過(guò)折光率低的空氣（折光率為1.0）而散失，因而能提高物鏡的分辯率，使物像敞亮明了（見(jiàn)下圖）

圖2介質(zhì)為空氣（A）與介質(zhì)為香柏油（B）時(shí)光線通過(guò)的比較

B、簡(jiǎn)單染色的原理

細(xì)菌的涂片和染色是微生物學(xué)試驗(yàn)中的一項(xiàng)基本技術(shù)。細(xì)菌的細(xì)胞小而透明，在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必需對(duì)它們進(jìn)行染色。利用單一染料對(duì)菌體進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更明白地觀測(cè)到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)的方法叫做簡(jiǎn)單染色。此法操作簡(jiǎn)便，適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀測(cè)。

常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，這是由于在中性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞尋常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很簡(jiǎn)單與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成顯明的對(duì)比，在顯微鏡下更易于識(shí)別。常用作簡(jiǎn)單染色的染料有美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。

當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，此時(shí)可用伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料染色。

染色前必需固定細(xì)菌，其目的有二：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上；

二是增加其對(duì)染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時(shí)盡量維持細(xì)胞原有的形態(tài)。C、革蘭氏染色的基本原理

革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。革蘭氏染色法不僅能觀測(cè)到細(xì)菌的形態(tài)

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而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G-表示。細(xì)菌對(duì)于革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過(guò)程中，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保存在細(xì)胞內(nèi)而不易脫色，因此，浮現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液（番紅）的顏色，因此浮現(xiàn)紅色。

革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料初染液；媒染劑；脫色劑和復(fù)染液。堿性染料初染液的作用象在細(xì)菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫。媒染劑的作用是增加染料和細(xì)胞之間的親和性或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細(xì)胞上，使不易脫落，碘是常用的媒染劑。脫色劑是將被染色的細(xì)胞進(jìn)行脫色，不同類型的細(xì)胞脫色反應(yīng)不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95％的酒精。復(fù)染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復(fù)染的目的是使被脫色的細(xì)胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細(xì)胞依舊保持初染的顏色，從而將細(xì)胞區(qū)分成G和G-兩大類群，常用的復(fù)染液是番紅。

經(jīng)此法染色后，細(xì)胞保存初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌；細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復(fù)染劑的顏色（紅色）的細(xì)菌為革蘭氏陰性菌。

G+G-

1）G＋菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)狀分子形成一種透性障，當(dāng)乙醇脫色時(shí)，肽聚糖脫水而孔障縮小，故保存結(jié)晶紫-碘復(fù)合物在細(xì)胞膜上。呈紫色。

2）Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，其脂含量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，沙黃復(fù)染后呈紅色。

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A顯微鏡的使用方法

1、安放

右手握住鏡臂，左手托住鏡座，使鏡體保持直立。桌面要清潔、平穩(wěn)，要開(kāi)啟試驗(yàn)臺(tái)上的燈光。

2、低倍鏡觀測(cè)

先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)光旋鈕（可變電壓調(diào)理旋鈕），調(diào)好光線，將物鏡提高，向下調(diào)至看到標(biāo)本，再用細(xì)調(diào)對(duì)準(zhǔn)焦距進(jìn)行觀測(cè)。

3、高倍鏡觀測(cè)

顯微鏡的設(shè)計(jì)一般是共焦點(diǎn)的。低倍鏡對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)后，轉(zhuǎn)換到高倍鏡基本上也對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)，只要稍微轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)即可。

4、油浸鏡觀測(cè)

油浸鏡的工作距離很小，所以要防止載皮片和物鏡上的透鏡損壞。使用時(shí)，一般是經(jīng)低倍、高倍到油浸鏡。當(dāng)高倍物鏡對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本后，再加油浸鏡觀測(cè)。載玻片標(biāo)本也可以不經(jīng)過(guò)低倍和高倍物鏡，直接用油浸鏡觀測(cè)。顯微鏡有自動(dòng)止降裝置的，載玻片上加油以后，將油浸鏡下移到油滴中，到中止下降為止，然后用微調(diào)向上調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)。沒(méi)有自動(dòng)止降裝置的，對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)的方法是從顯微鏡的側(cè)面觀測(cè)，將油浸鏡下移到與載玻片稍微接觸為止，然后用微調(diào)向上提升調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)。

使用油浸鏡時(shí)，鏡臺(tái)要保持水平，防止油滾動(dòng)。油浸鏡所用的油要清白，聚光鏡要提高到最高點(diǎn)，并放大聚光鏡下的虹彩光圈，否則會(huì)降低數(shù)值口徑而影響分辯率。無(wú)論是油浸鏡或高倍鏡觀測(cè)，都宜用可調(diào)理的顯微鏡燈作光源。B簡(jiǎn)單染色

1、流程圖：、

洗片、枯燥涂片加熱、固定、枯燥染色

水洗鏡檢枯燥2、具體步驟：1)洗片、枯燥

取一塊載玻片，用水浸濕，用手使用去污粉洗凈玻片，樹(shù)立在一邊自然枯燥?？菰锖笤诓Ｆ囊幻嬗糜浱?hào)筆做好標(biāo)記。便利以后水洗染料，避免洗去細(xì)菌。

2)涂片

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取一塊載玻片，在上邊用膠頭滴管加半滴無(wú)菌水，用接種環(huán)無(wú)菌操作將沾有菌的接種環(huán)置于載玻片上的無(wú)菌水種涂抹，待看到微弱的渾濁即可；（注意取菌不要太多，但是大腸桿菌較小，為短桿狀，可適當(dāng)多取）；

3)枯燥與固定

涂菌面朝上，通過(guò)火焰以枯燥并固定菌物，固定過(guò)程應(yīng)使載玻片通過(guò)火焰2-3次，注意溫度的控制，過(guò)熱的溫度會(huì)將細(xì)菌殺死，溫度以手背感覺(jué)微微發(fā)燙為標(biāo)準(zhǔn)；

4)染色

將載玻片平放于載波片支架上，滴加結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位即可，染色1-2min5)水洗

傾去染液，將載玻片的涂菌面朝下，自來(lái)水沖洗，水流不宜太急、太大，至洗出水無(wú)色為止；

6)枯燥

用吸水紙吸去多余水分后自然枯燥；7)鏡檢將制備好的樣片置于顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)，先低倍觀測(cè)，再高倍觀測(cè)，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀測(cè)細(xì)菌的形態(tài)。c）革