微生物的誘變育種

微生物的誘變育種第1頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四一、誘變育種中的幾個(gè)原則

指利用物理或化學(xué)誘變劑處理微生物群體細(xì)胞，促進(jìn)其突變率顯著提高，然后設(shè)法從中選取少數(shù)符合育種目的的突變株。2個(gè)主要環(huán)節(jié)：誘變（隨機(jī)）選用合適的誘變劑和誘變劑量處理大量均勻、分散的微生物細(xì)胞，以引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時(shí)，使存活個(gè)體中的突變頻率大大提高。篩選（定向）設(shè)計(jì)有效的篩選方法，將少量正變株中的優(yōu)良菌株挑選出來。第2頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四（一）出發(fā)菌株（originalstrain）出發(fā)菌株指用于誘變育種的起始菌株。具有有利性狀（如高產(chǎn)、生長速度快、營養(yǎng)要求粗放、標(biāo)記明顯等）；對誘變劑敏感野生型菌株；從生產(chǎn)中選育的自發(fā)突變菌株；誘變獲得的高產(chǎn)菌株出發(fā)菌株的選擇標(biāo)準(zhǔn)：出發(fā)菌株的來源：第3頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四（二）菌懸液的制備1.選用單細(xì)胞或單孢子懸液（均勻、分散）目的：①使每個(gè)細(xì)胞能均勻接觸誘變劑；

②減少表型延遲現(xiàn)象（誘變后性狀的分離及退化現(xiàn)象）2.同步培養(yǎng)（生理狀態(tài)一致）3.菌齡：對誘變劑最敏感時(shí)期

營養(yǎng)細(xì)胞：對數(shù)期孢子或芽孢：萌發(fā)前期4.菌懸液的制備方法

物理誘變：生理鹽水配制化學(xué)誘變：緩沖液配制5.菌懸液的濃度

酵母菌，霉菌的孢子：106個(gè)/mL

細(xì)菌，放線菌孢子：108個(gè)/mL

第4頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四（三）誘變劑的選擇及處理方法1.誘變劑的選擇（高效，簡便）物理誘變劑：頻度低、大損傷，難修復(fù)，且操作簡便；

化學(xué)誘變劑：頻度高，點(diǎn)突變，易回復(fù)突變，操作麻煩。(NTG——超誘變劑）UV是最常用的一種誘變劑第5頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四2.劑量的選擇突變率隨劑量的增加而提高，但到達(dá)一定程度后，再提高劑量,反而會(huì)使突變率下降。正變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負(fù)變較多出現(xiàn)在偏高劑量中。在產(chǎn)量變異工作中，常采用相對殺菌率為70~75%,甚至30~70%的劑量。UV的劑量:固定UV功率和照射距離,以照射時(shí)間長短來確定劑量多少。最適劑量：在提高突變率的基礎(chǔ)上，既能擴(kuò)大變異幅度，又能使變異向正突變范圍移動(dòng)的劑量。常以殺菌率來表示相對劑量（劑量-存活率曲線）第6頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四3.誘變處理方法單因素處理或多因素的復(fù)合處理：①同一誘變劑的重復(fù)使用；②兩種或多種誘變劑的先后使用；③兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用.第7頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四（四）中間培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)過夜）目的：克服表型延遲表型延遲（phenotypiclag）：表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象.

分離性延遲：

突變的基因經(jīng)DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后變成純合狀態(tài)，表型才能表現(xiàn)出來。

生理性延遲：

由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)，突變表型仍不能表現(xiàn)出來。分離性延遲的原因:對數(shù)生長期中，單核細(xì)胞常出現(xiàn)雙核現(xiàn)象，多核細(xì)胞的核也成倍增加，誘變對數(shù)期的細(xì)胞時(shí)，突變通常發(fā)生在一個(gè)核上，故其變異或非變異的細(xì)胞必須經(jīng)過一代或幾代繁殖才能分離，這種純種變異細(xì)胞出現(xiàn)的推遲現(xiàn)象稱為分離延遲現(xiàn)象。生理性延遲的原因:當(dāng)變異細(xì)胞由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)時(shí),由于雜合期所合成的非變異的蛋白或酶仍然發(fā)揮作用,必須經(jīng)過細(xì)胞多代分離后,才能將這些非變異的酶稀釋掉,最終達(dá)到變異后應(yīng)該表現(xiàn)的形態(tài),如營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選過程。生理性延遲:第8頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四（五）突變株的篩選

初篩復(fù)篩1.初篩（以量為主）（1）利用形態(tài)變異：需預(yù)先測定形態(tài)與產(chǎn)量的相關(guān)性（2）根據(jù)平板顏色反應(yīng)直接挑選透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶）；抑菌圈法（抗生素）；變色圈法（檸檬酸）、顯色圈（氨基酸）；沉淀圈法（外毒素）透明圈直徑（H）/菌落直徑（C）：產(chǎn)量高低（初篩指標(biāo)）2.復(fù)篩（以質(zhì)為主，定量測定）搖瓶培養(yǎng)，直接檢測所需產(chǎn)物方法需簡便、快速2步第9頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四誘變育種的基本原則：選擇簡便有效的誘變劑；挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株；處理單細(xì)胞或單孢子懸液；選用最適的誘變劑量；充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)；利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)；設(shè)計(jì)高效篩選方案；創(chuàng)造新型篩選方法。第10頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四二、幾種重要突變株的篩選方法1.抗性突變株的篩選(1)抗終代謝物結(jié)構(gòu)類似物突變株的篩選(2)抗藥性突變株篩選2.營養(yǎng)缺陷型的篩選第11頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四

1.抗性突變株的篩選

（1）抗終代謝物結(jié)構(gòu)類似物的突變株

用途：篩選相應(yīng)代謝物的高產(chǎn)菌株（2）抗藥性突變株

用途：篩選相應(yīng)藥物(抗生素)的高產(chǎn)菌株或遺傳標(biāo)記制作

篩選的方法:

a.高于臨界濃度的平板進(jìn)行分離；

b.梯度平板法

敏感菌苔

抗性菌落加入含異煙肼的上層

加入不含異煙肼的底層

所謂結(jié)構(gòu)類似物（又稱代謝拮抗物）是指那些在結(jié)構(gòu)上和代謝終產(chǎn)物（氨基酸、嘌呤、維生素等）相似的物質(zhì)。如：異煙肼（“雷米封”）是吡哆醇的結(jié)構(gòu)類似物，利用含異煙肼梯度平板篩選異煙肼抗性突變株，可達(dá)到定向培育吡哆醇高產(chǎn)突變株的目的。為什么在篩選突變株時(shí),不能直接用代謝產(chǎn)物,而必須用其結(jié)構(gòu)類似物?第12頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四2.營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選（1）幾個(gè)概念：三類培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基（MM,minimalmedium）[-]：某野生型能生長的最低成分的組合培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM,completemedium）[+]：各種營養(yǎng)缺陷型能生長的天然或半組合培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM,supplementalmedium）[A]:[-]+A[B]:[-]+B相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型能生長的組合或半組合培養(yǎng)基第13頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四三種遺傳型：野生型（wildtype）從自然界分離到的、發(fā)生營養(yǎng)缺陷型突變前的原始菌株。[A+B+],可在[-]生長。營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）野生型菌株經(jīng)誘變劑處理后，由于發(fā)生了喪失某種酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長的突變菌株（主要指合成維生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。

[A+B-]：能在[+]、[B]生長

[A-B+]：能在[+]、[A]生長

[A-B-]：能在[+]生長原養(yǎng)型（prototroph）營養(yǎng)缺陷型經(jīng)回復(fù)突變或重組，回到原來野生型的營養(yǎng)要求[A+B+],可在[-]生長第14頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四（2）篩選步驟（5步）誘變處理中間培養(yǎng)淘汰野生型檢出缺陷型鑒定缺陷型第15頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四①中間培養(yǎng)CM或SM培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。克服表型延遲。②淘汰野生型即濃縮缺陷型，以提高檢出率方法

抗生素法（G+細(xì)菌：青霉素；酵母菌和霉菌：制霉菌素）

菌絲過濾法（絲狀真菌、放線菌）

饑餓培養(yǎng)（無N）MM6~12h2N培養(yǎng)(2N)MM1~2h加抗生素(或菌絲過濾)，培養(yǎng)過夜第16頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四③營養(yǎng)缺陷型的檢出方法逐個(gè)檢出法夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法影印平板法第17頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四④營養(yǎng)缺陷型的鑒定生長譜法：快速，直觀分兩步：a.三大類營養(yǎng)要求（氨基酸、維生素、核苷酸）的鑒定b.具體到某一種營養(yǎng)要求的鑒定(哪一種氨基酸,哪一種維生素,或哪一種堿基)具體操作:一般采用“濾紙片法”第18頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四

a.不含維生素的酪素水解液或氨基酸混合液

b.維生素混合液

c.0.1%堿水解酵母核酸液abc三大類營養(yǎng)要求的鑒定：第19頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四以氨基酸缺陷為例進(jìn)行說明將18種氨基酸按右表分為6組特點(diǎn)：每2組只有一種共同物質(zhì)單一營養(yǎng)物質(zhì)要求的鑒定：組別化合物代號(hào)117891011227121314153381216171844913161920551014171921661115182021135246第20頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四（3）營養(yǎng)缺陷型的用途生產(chǎn)菌(氨基酸、核苷酸、維生素等高產(chǎn)菌需求)；研究代謝途徑和雜交、轉(zhuǎn)化等遺傳規(guī)律的遺傳標(biāo)記。第21頁，共23頁，2023年，2月20日，星期四

誘變育種的程序：實(shí)驗(yàn)講義p175

出發(fā)菌株（純化）前培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)至對數(shù)期）

菌懸液制備活菌計(jì)數(shù)

誘變預(yù)備實(shí)驗(yàn)（劑量存活率曲線）

誘變處理（相對殺菌率為70-75%，30-70%）活菌計(jì)數(shù)

中間培養(yǎng)（CM，培養(yǎng)過夜，克服表型延遲）

突變株分離

初篩

復(fù)篩