怎樣選擇色譜柱液相色譜柱的種類與方法開發(fā)

怎樣選擇色譜柱液相色譜柱的種類與方法開發(fā)第1頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四內(nèi)容概要色譜基本概念回顧色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)第2頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四色譜基本概念回顧

第3頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四色譜（chromatography）色譜原理色譜分類：氣相/液相和高效液相（HPLC）；反相/正相/離子交換/HILIC/混合固定相色譜功能：分析（種類/定量），純化液相色譜儀器結(jié)構(gòu)及功能：泵，脫氣機(jī)，混合器，進(jìn)樣器（閥），色譜柱，柱溫箱，檢測(cè)器（流通池）第4頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四分離度

Rs-ResolutionN–TheoreticalPlateNumberα–Selectivityk–RetentionFactor拖尾第5頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1.SeparationofCompoundsAandB第6頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四靈敏度ＬＯＤ：LimitofDetectionＬＯＱ：LimitofQuantification

－柱效－峰形（拖尾因子）

第7頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四重現(xiàn)性分離度（Ｒ）－保留時(shí)間（Ｖ，Ｔ，Ｋ）－選擇性（α）－柱效（Ｎ）靈敏度

第8頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)第9頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四色譜柱與色譜條件對(duì)色譜性能的影響分離度《

-選擇性〈鍵合類型，基質(zhì)表面特性；流動(dòng)相、溫度

-柱效〈保留體積，粒徑，柱長(zhǎng)，基質(zhì)表面特性；流動(dòng)相，溫度，上樣量，流速峰對(duì)稱性《基質(zhì)表面特性，鍵合類型，流動(dòng)相，溫度保留體積《柱長(zhǎng)，孔隙率，比表面積，基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度靈敏度《粒徑，基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度穩(wěn)定性和重現(xiàn)性《基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度流動(dòng)相《

pH，緩沖鹽種類，溶劑；第10頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四影響色譜柱性能的主要因素1、色譜柱的構(gòu)型

色譜柱內(nèi)徑色譜柱長(zhǎng)度2、

固定相柱填料粒徑比表面積孔徑孔隙率基質(zhì)表面特性：

-表面活性：硅膠純度、硅羥基的酸性、均勻性和數(shù)量-耐堿性鍵合類型-官能團(tuán)、是否封尾

-鍵合相的保留行為、耐酸性第11頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四色譜柱的構(gòu)型對(duì)色譜柱性能的影響第12頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四色譜柱的構(gòu)型對(duì)色譜柱性能的影響：長(zhǎng)度和直徑色譜柱尺寸對(duì)色譜分離的影響：?短柱(15-100mm)-運(yùn)行時(shí)間短,柱壓低

?長(zhǎng)柱(150-250mm)-分辨率高,運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)

?窄徑柱(2.1mm)–滿足檢測(cè)器和樣品量限制

?寬徑柱(3-7.8mm)-載樣量高，抗污染，壽命

制備柱

(內(nèi)徑>10mm)–用于純化制備第13頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四柱填料對(duì)色譜柱性能的影響第14頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：粒徑

硅膠粒徑和類型對(duì)柱效的影響d硅膠粒徑和類型對(duì)壓力的影響第15頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：粒徑II

目前市場(chǎng)主要可供選擇的填料粒徑1.7μm，1.8μm，2.2μm－快速液相色譜柱：匹配快速色譜儀

2.7μm－多孔殼層：在常規(guī)液相色譜儀上實(shí)現(xiàn)快速分離(Halo)3.0μm，3.5μm－普通快速分析5.0μm－常規(guī)分析顆粒越小，柱效越高,但是耐污染性能下降，柱壓升高.第16頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：比表面積

每克填料的表面積，與粒度，孔徑有關(guān)比表面積大，保留增加，載樣量增加，平衡時(shí)間增加(梯度洗脫尤為注意)根據(jù)需要選擇合適的比表面積第17頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：孔徑I

多孔材料的95%以上表面在孔內(nèi)部樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進(jìn)入微粒內(nèi)部孔徑至少是樣品流體學(xué)直徑的4倍

300?孔徑用于：超過50個(gè)氨基酸的肽或25個(gè)殘基的低聚寡核苷酸樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進(jìn)入微粒內(nèi)部第18頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：孔徑II

由于小孔徑填料比表面積大，小分子的保留值在小孔徑填料通常更大條件： C8色譜柱，4.6×150mm， 3.5um，A溶劑，0.1%TFA水溶液；B溶劑，0.1%TFA于80%乙腈－

水中；20min梯度，10 30%B；60°C， 1.5ml/min第19頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：硅膠純度I2.3-二羥基萘2.7-二羥基萘TF=1.31BrandW,AQColumn5μm,4.6mm×150mm

BrandZ,C18Column5μm,4.6mm×150mm

VenusilMPC185μm,4.6mm×150mmBrandH,C18Column5μm,4.6mm×150mmBrandU,C18Column5μm,4.6mm×150mm！TF=1.42TF=1.39TF=1.69TF=？流動(dòng)相：

甲醇：水=65：35流速：

1mL/min溫度： 35℃檢測(cè)波長(zhǎng)： 230nm進(jìn)樣量： 20μL硅膠純度－金屬含量第20頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四硅膠基質(zhì)類型及發(fā)展史TypeA：原料來源：水玻璃；高金屬含量，高活性，極性化合物容易形成拖尾和死吸附TypeB：原料來源：有機(jī)硅烷（四乙氧基硅烷）水解/燒結(jié)/酸洗雜化及表面雜化整體柱殼層柱第21頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：硅膠純度II

硅膠純度－金屬含量d第22頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四固定相對(duì)色譜柱性能的影響：硅羥基的影響殘余硅羥基的影響普通硅膠當(dāng)流動(dòng)相的pH值大于4.5-5.0時(shí)，表面的硅羥基會(huì)帶負(fù)電荷，堿性化合物拖尾。解決方法封尾雙層表面修飾表面雜化第23頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四固定相對(duì)色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響封尾鍵合填料與小硅烷進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，如三甲基氯硅烷，反應(yīng)掉部分殘余硅羥基，以增加表面覆蓋率。缺點(diǎn)：不能完全反應(yīng)（仍有50%的硅羥基未被反應(yīng)）在pH<3時(shí)，TMS易流失，耐用性，穩(wěn)定性不好TMS第24頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四固定相對(duì)色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響不同長(zhǎng)度和體積的鍵合相對(duì)表面覆蓋率的影響第25頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四固定相對(duì)色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響雙層表面修飾降低表面硅羥基活性，硅膠表面更加均勻第26頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四固定相對(duì)色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響硅膠雙層表面修飾后

新增加表面層硅羥基活性更低－新硅羥基pH=5.2，普通硅羥基pH約為3.5更對(duì)稱的峰型，提高柱效，提高靈敏度

硅膠表面更均勻－硅膠微晶形成過程中的不光滑表面被覆蓋重現(xiàn)性更好

表面純度更高－硅膠金屬雜質(zhì)被覆蓋極性化合物保留和分離更好第27頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四鍵性化合物峰形對(duì)比

Testconditions:Columndimension:4.6mmx150mmSample:doxepin,nortriptyline,trimipramineamitriptylineMobilephase:Acetonitrile/0.01Msodiumphosphate(pH=6)=70/30Temperature:30oCFlow:1mL/minDetection:UV254nmBrandAC18(non-endcapped,)C18(non-endcapped,twin-layer第28頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ASBC18ZorbaxSBC18SaponinsExtract

4.6x150mmcolumn,1%formicacid/MeOH=80/20第29頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四固定相對(duì)色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響雙層表面修飾代表產(chǎn)品：StableBondC18，PolarBondC18，SurfBondC180.01ng/mLPseudoephedrineAUMIBauloStableBondC18,2.1×50mm,5μmBrand

A

C182.1×50mm,5μmPhenomenexLunaC18,2.0×50mm,5μm第30頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四固定相對(duì)色譜柱性能的影響：鍵合類型A縱向交聯(lián)：保留和選擇不穩(wěn)定B橫向交聯(lián)：寬pH適用C單體鍵合：重現(xiàn)性好，柱效高D單體（空間保護(hù)）：低pH穩(wěn)定Ｅ極性官能團(tuán)嵌合反相固定相第31頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四固定相對(duì)色譜柱性能的影響：

基質(zhì)表面特性+鍵合類型〉反相鍵合相的保留行為同一廠家相同硅膠基質(zhì)的反相柱：

保留值隨含碳量的增加而增加比表面積越大，保留值越大鍵合碳鏈越長(zhǎng)，保留越大C18

C8>C3>C1，長(zhǎng)鏈之間差別不大≈第32頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四反相鍵合相的保留行為不同廠家色譜柱的保留值，選擇性與峰型色譜柱：4.6*150mm，流動(dòng)相：乙腈－0.05M磷酸鉀緩沖液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，拖尾峰T0（尿嘧啶）P:

吡啶L:

苯酚N:

N,N-二甲基苯胺

B:

4-丁基苯甲酸J:

甲苯第33頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四固定相對(duì)色譜柱性能的影響：

基質(zhì)表面特性+鍵合類型〉鍵合相的穩(wěn)定性鍵合相的穩(wěn)定性

低pH值，鍵合相流失高pH值，硅膠溶解影響色譜柱壽命，方法不重現(xiàn)

第34頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四鍵合類型對(duì)鍵合相穩(wěn)定性影響低pH值，鍵合相流失第35頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四鍵合類型對(duì)鍵合相穩(wěn)定性影響（II）空間位阻保護(hù)，延緩鍵合相流失第36頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期四固定相對(duì)色譜柱性能的影響：鍵合硅膠的穩(wěn)定性高pH