現(xiàn)代生物技術在發(fā)酵工業(yè)中的應用已

第十二章現(xiàn)代生物技術在發(fā) 酵工業(yè)中的應用第一節(jié)概述第二節(jié)工程菌的發(fā)酵第三節(jié)動植物細胞的組織培養(yǎng)第四節(jié)固定化細胞發(fā)酵現(xiàn)在是1頁\一共有120頁\編輯于星期二第一節(jié)概述生物技術(biotechnology)，又稱生物工程或生物工藝學等。它是近代發(fā)展非常迅速的一門綜合性科學技術，涉及許多科學領域。生物技術是應用生物科學的理論、方法和技術，按照人們設計的藍圖，改良和加工生物或用生物及其制備物作為加工原料，提供所需的生物制品，為人類服務的綜合性科學技術。現(xiàn)在是2頁\一共有120頁\編輯于星期二綜合性科學技術知識密集型新產(chǎn)業(yè)應用領域很寬（農(nóng)、工、食、藥等）

現(xiàn)在是3頁\一共有120頁\編輯于星期二發(fā)酵工程是生物技術產(chǎn)業(yè)化的基礎和關鍵技術，是生物技術四大支柱的核心，無論傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，如抗生素、氨基酸等，還是現(xiàn)代基因工程產(chǎn)品，如疫苗、人體蛋白質等，都需要發(fā)酵技術進行生產(chǎn)。生物技術中，當前人們最感興趣的是基因工程和細胞工程，它們是生物技術的主導領域，也是熱點。發(fā)酵工程和酶工程等也是生物技術中的重要組成部分。這幾方面的內容是相互聯(lián)系和互相促進的?，F(xiàn)在是4頁\一共有120頁\編輯于星期二1、工程菌的來源

基因工程菌：在生物體外對DNA分子進行重新組合，然后克隆到適合的宿主細胞，進行增殖和表達，所得到的重組菌株即是工程菌。2、生產(chǎn)用工程菌應具備條件①產(chǎn)品高濃度、高轉化率和高產(chǎn)率；分泌型菌株最好；②能利用常用的碳源(如糖蜜、淀粉等)，并可進行連續(xù)培養(yǎng)；③菌株不致病，也不產(chǎn)生內毒素；④發(fā)酵所產(chǎn)生的熱量和需氧量都低，發(fā)酵溫度適當；⑤代謝控制容易進行；⑥重組DNA穩(wěn)定，不易脫落。第二節(jié)工程菌的發(fā)酵一、工程菌的來源和應用現(xiàn)在是5頁\一共有120頁\編輯于星期二3、工程菌的應用蛋白類藥物產(chǎn)品：如胰島素、干擾素、生長激素等，還有幾十種正在開發(fā)中。氨基酸生產(chǎn)：如高產(chǎn)的蘇氨酸工程菌。維生素生產(chǎn)：能直接轉化葡萄糖為2-酮基-L-古龍酸的工程菌，為維生素C生產(chǎn)開辟了新的途徑。抗生素生產(chǎn)：如將頭孢菌素生物合成的限制性擴環(huán)酶基因克隆到產(chǎn)生菌中，使頭孢菌素C的產(chǎn)量提高了15％?，F(xiàn)在是6頁\一共有120頁\編輯于星期二比較成熟的基因工程產(chǎn)品現(xiàn)在是7頁\一共有120頁\編輯于星期二

(一)基因重組細胞的種類原核：大腸桿菌和枯草桿菌真核：酵母菌和哺乳動物細胞等。

二、工程菌的培養(yǎng)現(xiàn)在是8頁\一共有120頁\編輯于星期二

(二)工程菌的培養(yǎng)

工程菌培養(yǎng)：類似于普通微生物的培養(yǎng)。另外要考慮：營養(yǎng)物質的濃度有毒代謝物質的排放導入基因的穩(wěn)定性基因的轉錄效率、翻譯產(chǎn)物向外分泌等因素。現(xiàn)在是9頁\一共有120頁\編輯于星期二1．培養(yǎng)裝置重組大腸桿菌——通氣攪拌罐實驗室中以基礎實驗設備進行（一般采用通氣攪拌發(fā)酵罐，如：大腸桿菌）；但操作要謹慎，防止工程菌株的外漏和擴散；中試試驗必須要有良好的重復性，應用全自動的控制系統(tǒng)，減少接觸，并且盡可能地獲得大量的發(fā)酵參數(shù)。工程菌的培養(yǎng)裝置既要防止外界微生物侵入罐內，污染雜菌，又必須不使重組體外漏。這是與沿用的通氣攪拌式培養(yǎng)罐的區(qū)別所在。重組動物細胞——動物細胞培養(yǎng)裝置(安瓿瓶)現(xiàn)在是10頁\一共有120頁\編輯于星期二2．培養(yǎng)基和高密度發(fā)酵

工程菌發(fā)酵有兩條基本要求：使菌體生長良好，獲得高濃度菌體(即高密度發(fā)酵)，才能得到最多的產(chǎn)物。

一般的微生物發(fā)酵菌體干重：大腸桿菌125g/L；釀酒酵母145g/L?；蚬こ叹?，一般達到200g/L。其次，發(fā)酵用培養(yǎng)基盡可能的簡單，以便分離產(chǎn)物。使用合成培養(yǎng)基，包括葡萄糖、銨鹽和無機鹽等。使用盡可能廉價的維生素或氨基酸的營養(yǎng)缺陷型的工程菌?，F(xiàn)在是11頁\一共有120頁\編輯于星期二3．菌株和質粒的穩(wěn)定性

工程菌中的質粒的穩(wěn)定性（傳代）和質粒內在的穩(wěn)定性很重要。質粒保存率高，相應地就會得到高濃度的產(chǎn)物?？衫觅|粒帶氨芐青霉素等抗生素抗性標記。目前多采用兩個以上的抗生素抗性標記的質粒，帶有這種質粒的菌株在藥物的存在下能夠生長，反之則菌株則不能夠生長。利用這種選擇性，還可以對工程菌遺傳穩(wěn)定性進行檢測。

現(xiàn)在是12頁\一共有120頁\編輯于星期二

三、安全問題（一）重組DNA實驗準則

準則主內容：物理密封（P1～P4）和生物學密封（B1和B2）物理密封：將重組菌封閉于設備內，以防止傳染給實驗人員和向外界擴散。（實驗設備、實驗室設計、試驗注意事項）生物學密封：用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主（如維生素或氨基酸營養(yǎng)缺陷型），同時用不能轉移至其它活細胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴散。現(xiàn)在是13頁\一共有120頁\編輯于星期二重組菌株外漏的可能性主要有：機械密封；接種；排氣；取樣；放罐等。培養(yǎng)裝置能夠防止重組體外漏和雜菌的侵入，并且能夠密閉滅菌；尾氣排除要有除菌裝置，如果有氣溶膠產(chǎn)生必須要有收集氣溶膠的設備；發(fā)酵后的下游工作必須在密閉設備或者安全柜內進行。工業(yè)生產(chǎn)中重組菌培養(yǎng)的設備標準（LS1，LS2）現(xiàn)在是14頁\一共有120頁\編輯于星期二

(二)防止基因重組菌外漏的措施

培養(yǎng)工程菌的外界條件至少要遵守物理密封(P1～P4)方法中的P1級規(guī)定。從生物安全性來考慮，常采用維生素或氨基酸營養(yǎng)缺陷型的工程菌。生產(chǎn)中，以下部分和操作均應采取一些措施，以防重組菌外漏：①排氣；②機械密封；③取樣；④培養(yǎng)后的滅菌；⑤接種；⑥放罐。

企業(yè)中進行重組菌培養(yǎng)的設備標準有LS-1和LS-2。現(xiàn)在是15頁\一共有120頁\編輯于星期二1.概念第三節(jié)動植物細胞的組織培養(yǎng)一、動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)：將來自動物的某些器官或組織細胞，在模擬體內生理條件下進行體外培養(yǎng)使之存活和生長。（1975年后進入了新的階段：基因工程細胞猴腎細胞產(chǎn)生生長激素1mg/d）。目前的單細胞狀態(tài)培養(yǎng)早期的組織片培養(yǎng)現(xiàn)在是16頁\一共有120頁\編輯于星期二2.動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物類型目前利用動物細胞生產(chǎn)的藥物有5大類：1）病毒疫苗。如脊髓灰質炎、狂犬病、乙型肝炎等疫苗。2）免疫調節(jié)劑。如干擾素、白細胞介素、胸腺素、轉移抑制因子等。3）激素。如絨毛促性腺素、生長激素、促紅細胞生成素等。4）人體活性蛋白。如胰島素、血纖維蛋白溶酶原。5）藥用酶。尿激酶、天門冬酰胺酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。現(xiàn)在是17頁\一共有120頁\編輯于星期二動物胚胎幼齡動物器官細胞懸浮液10代細胞50代細胞原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（1）原代（初代）培養(yǎng)細胞：動物組織經(jīng)過切碎、化學或酶處理得到的細胞，在培養(yǎng)期內（50代左右）其生長性狀保持正常（一般20代左右的細胞可以作為種細胞凍存，生產(chǎn)疫苗、尿激酶和干擾素等）。3.動物細胞的性質（2）確立細胞株：原代培養(yǎng)的細胞經(jīng)過反復分裂出現(xiàn)變異，能夠在體外培養(yǎng)時無限制性得增殖，其形態(tài)遺傳因子抗原性等都失去了原有的特性?，F(xiàn)在是18頁\一共有120頁\編輯于星期二（3）移植繼代培養(yǎng)：用酶液處理的貼壁附著細胞可以分散為單層細胞，繼續(xù)培養(yǎng)又可形成貼壁細胞（細胞株）。成纖維細胞與確立細胞株繼代培養(yǎng)的細胞，經(jīng)過幾代反復分裂為成纖維細胞，大部分不具有癌化性，保留原代培養(yǎng)細胞的特性；到分裂至50代左右分裂停止，繼而死亡；此過程中少部分發(fā)生變異為確立細胞株。確立細胞株：有無限增殖的繁殖特性（遺傳物質發(fā)生改變），大多數(shù)情況下可以進行大量懸浮培養(yǎng)，但具有癌化性質?，F(xiàn)在是19頁\一共有120頁\編輯于星期二細胞來源：胚胎及成幼齡動物的組織器官單個細胞原代細胞細胞株細胞系剪碎胰蛋白酶分離細胞洗滌、稀釋、分離原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)遺傳物質沒有發(fā)生改變遺傳物質發(fā)生改變現(xiàn)在是20頁\一共有120頁\編輯于星期二動物細胞培養(yǎng)現(xiàn)在是21頁\一共有120頁\編輯于星期二目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細胞及人二倍體細胞、cho（中華倉鼠卵巢）細胞、BHK-21(倉鼠腎細胞)、Vero細胞(非洲綠猴腎傳代細胞，是貼壁依賴的成纖維細胞)等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品?，F(xiàn)在是22頁\一共有120頁\編輯于星期二2.培養(yǎng)條件溫度為37℃±0.5℃

pH接近中性6.8-7.6，，多數(shù)細胞對偏酸性的環(huán)境有耐受力；培養(yǎng)體系調節(jié)酸堿性利用CO2(NaHCO3)和細胞代謝產(chǎn)物組成的緩沖體系；氣體：氧，二氧化碳，氮氣；溶解氧的控制采用通氣量和攪拌轉速。目前常用的較多的是將硅氧管浸入培養(yǎng)液中，增加氣液接觸面。營養(yǎng)條件需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分可以由血清提供?，F(xiàn)在是23頁\一共有120頁\編輯于星期二1)實驗室儀器和設備：常規(guī)的細胞培養(yǎng)設備：如CO2孵箱；培養(yǎng)器材：如培養(yǎng)瓶，純水設備，干燥消毒除菌設備，清洗設備等。2)培養(yǎng)液：目前常用的基礎培養(yǎng)液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F(xiàn)12等，可根據(jù)培養(yǎng)需求合理選擇。現(xiàn)在是24頁\一共有120頁\編輯于星期二細胞培養(yǎng)轉瓶培養(yǎng)機現(xiàn)在是25頁\一共有120頁\編輯于星期二3)血清：一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動物血清。由于不同的研究目的，血清成分往往干擾研究實驗，如進行藥物和受體及營養(yǎng)等方面的研究時，需要使用無血清培養(yǎng)基。一、動物細胞培養(yǎng)現(xiàn)在是26頁\一共有120頁\編輯于星期二4)平衡鹽溶液：主要用于作為稀釋和灌注的液體，維持細胞滲透壓，提供緩沖系統(tǒng)，使培養(yǎng)液的酸堿度維持在培養(yǎng)細胞生理范圍內，提供細胞正常代謝所需的水分和無機離子等。常用的有PBS，Hank’s等。5)抗生素：常用為青霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100單位）和鏈霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100微克）。一、動物細胞培養(yǎng)現(xiàn)在是27頁\一共有120頁\編輯于星期二6)其它添加成分：緩沖系統(tǒng)，常用為HEPES，緩沖效能(pKa)在20℃時為7.55，37℃為7.31；HEPES不是起維持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH變化的，所以調整pH常常用NaHCO3溶液。有機補充物，如丙酮酸鈉，谷胺酰氨等。促細胞分裂因子，如生長因子類的FGF(成纖維細胞生長因子)，EGF(表皮生長因子)。貼壁和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等?？筛鶕?jù)培養(yǎng)細胞的特殊要求進行添加。一、動物細胞培養(yǎng)現(xiàn)在是28頁\一共有120頁\編輯于星期二3.動物細胞培養(yǎng)特性除單細胞原生動物外，細胞培養(yǎng)過程具有以下特性：①細胞生長緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時需用抗生素；②動物細胞較微生物大得多．無細胞壁，機械強度低，適應環(huán)境能力差；③培養(yǎng)過程需氧量少，且不耐受強力通風與攪拌形成的較大流體剪切力；④在培養(yǎng)中，細胞相互粘連以集群形式存在，培養(yǎng)過程具有群體效應、錨地依賴性、接觸抑制性及功能全能性；⑤產(chǎn)物分布于細胞內外，生產(chǎn)成本較高，但產(chǎn)品價格昂貴；⑥大規(guī)模培養(yǎng)時，不可照用微生物反應的經(jīng)驗；⑦原代培養(yǎng)細胞一般繁殖50代即退化死亡。現(xiàn)在是29頁\一共有120頁\編輯于星期二4.動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法

依細胞種類：原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)依培養(yǎng)容器和方式：靜止培養(yǎng)、旋轉培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)中空纖維培養(yǎng)、固定床或流化床培養(yǎng)依培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)從生產(chǎn)實際分為：懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)現(xiàn)在是30頁\一共有120頁\編輯于星期二4.動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法(1)貼壁培養(yǎng)是必須讓細胞貼附在某種基質上生長繁殖的培養(yǎng)方法。適用于一切貼壁依賴性細胞，也適用于兼性貼壁細胞。圓形的細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展呈多種形態(tài)。此后細胞就開始有絲分裂并很快進入對數(shù)生長期。一般在數(shù)天后就鋪滿生長表面，形成致密的單層細胞。這種培養(yǎng)的方法又叫單層細胞培養(yǎng)。接觸抑制：貼壁生長的細胞，當每個細胞與其周圍的細胞互相接觸時，細胞就停止增殖，長成單層的細胞。須在重新分散后，分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，才能繼續(xù)分裂增殖，這叫傳代?，F(xiàn)在是31頁\一共有120頁\編輯于星期二幾個概念貼壁依賴性細胞：需要有適量帶電荷的固體或半固體支持表面才能生長的細胞。大多數(shù)動物細胞都屬于此類。非貼壁依賴性細胞：不依賴于固體支持物表面生長的細胞，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，被稱為懸浮細胞。舉例：血液、淋巴細胞、腫瘤細胞和某些轉化細胞，Namalwa細胞。兼性貼壁依賴性細胞：對支持物的依賴性不嚴格，既可貼壁生長，也可懸浮生長。舉例：CHO細胞、BHK細胞、L929細胞。理想的藥物生產(chǎn)細胞系現(xiàn)在是32頁\一共有120頁\編輯于星期二貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點：

●容易更換培養(yǎng)液；細胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

●容易采用灌注培養(yǎng)，從而達到提高細胞密度的目的；因細胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。

●當細胞貼壁于生長基質時，很多細胞將更有效的表達一種產(chǎn)品。

●同一設備可采用不同的培養(yǎng)液/細胞的比例。

●適用于所有類型細胞。現(xiàn)在是33頁\一共有120頁\編輯于星期二貼壁培養(yǎng)的缺點：操作麻煩，傳代或擴大培養(yǎng)時需先消化，培養(yǎng)條件不易均一，傳質和傳氧較差。與懸浮培養(yǎng)法相比

●擴大培養(yǎng)比較困難，投資大；

●占地面積大；

●不能有效監(jiān)測細胞的生長；

現(xiàn)在是34頁\一共有120頁\編輯于星期二細胞貼壁的表面：要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機物表面，必須具有親水性，并帶陽電荷。貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)：主要有轉瓶、中空纖維（后面專題介紹）、玻璃珠、微載體系統(tǒng)（后面介紹）等。

現(xiàn)在是35頁\一共有120頁\編輯于星期二現(xiàn)在是36頁\一共有120頁\編輯于星期二轉瓶培養(yǎng)系統(tǒng)：培養(yǎng)貼壁依賴型細胞最初采用轉瓶系統(tǒng)培養(yǎng)。轉瓶培養(yǎng)一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應器接種細胞準備的一條途徑。細胞接種在旋轉的圓筒形培養(yǎng)器-轉瓶中，培養(yǎng)過程中轉瓶不斷旋轉，使細胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，從而提供較好的傳質和傳熱條件。

優(yōu)點：結構簡單，投資少，技術成熟，重復性好，放大只需簡單的增加轉瓶數(shù)量等。

缺點：勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細胞生長的表面積小，細胞生長密度低，培養(yǎng)時監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制等。

現(xiàn)在是37頁\一共有120頁\編輯于星期二反應器貼壁培養(yǎng)：此種培養(yǎng)方式中，細胞貼附于固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養(yǎng)液一起流動，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細胞和培養(yǎng)液的設備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細胞的生長情況，故多用于制備用量較小、價值高的生物藥品?，F(xiàn)在是38頁\一共有120頁\編輯于星期二(2)懸浮培養(yǎng)讓細胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內生長繁殖。適用于一切種類的非貼壁依賴性細胞（懸浮細胞），也適用于兼性貼壁細胞。由于動物細胞的特點，其培養(yǎng)方式在許多方面與經(jīng)典發(fā)酵不同。小規(guī)模：轉瓶和滾瓶培養(yǎng)，大規(guī)模：發(fā)酵罐式的細胞培養(yǎng)反應器。懸浮培養(yǎng)的關鍵是要選擇適當?shù)臄嚢韬屯庋b置。懸浮培養(yǎng)，設備結構簡單，有成熟的理論計算，可以借鑒微生物發(fā)酵的部分經(jīng)驗，放大效應小。但是懸浮培養(yǎng)的細胞密度較低，現(xiàn)在是39頁\一共有120頁\編輯于星期二優(yōu)點：操作簡便，培養(yǎng)條件比較單一，傳質和傳氧較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設備的設計和實際操作中可借鑒細菌發(fā)酵的經(jīng)驗；可連續(xù)收集部分細胞進行移植繼代培養(yǎng)，傳代時無需消化分散，免遭酶類、EDTA及機械損害；細胞收率高，并可連續(xù)測定細胞濃度，還有可能實現(xiàn)大規(guī)模直接克隆培養(yǎng)。缺點：細胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，細胞密度較低。轉化細胞懸浮培養(yǎng)有潛在致癌危險?，F(xiàn)在是40頁\一共有120頁\編輯于星期二無血清懸浮培養(yǎng)是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質量，正逐漸成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向?，F(xiàn)在是41頁\一共有120頁\編輯于星期二(3)微載體培養(yǎng)系統(tǒng)微載體是直徑為60～250μm的微珠（如葡聚糖Cytodex1微載體）。動物細胞貼壁于微載體上生長，微載體懸浮于培養(yǎng)基中，細胞在微載體表面逐漸生長成單層的培養(yǎng)方法，或稱微珠培養(yǎng)法。此方法把單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點融匯在一起。制備微載體的材料主要有：

葡聚糖明膠玻璃纖維素等現(xiàn)在是42頁\一共有120頁\編輯于星期二1967年，VanWezel開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細胞。微載體是直徑60-250μm的微珠。多用帶不同基團的葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子，使其帶有適當電荷或介質，以利于細胞的貼壁及生長。

例如：葡聚糖Cytodex1微載體大小60~87μm

，在培養(yǎng)液中膨脹160~230μm，每微克表面積0.6m2，相當于7個標準的旋轉瓶。（β-干擾素）現(xiàn)在是43頁\一共有120頁\編輯于星期二理想微載體需具備的條件微載體表面性質與細胞有良好的相容性；微載體的材料無毒性；微載體的材料是惰性材料；材料比重為1.030-1.045g/ml；粒徑60-250μm（溶脹后），大小均一；具有好的光學透明性；基質的性質是軟性的；可耐120℃高溫，便于采用高壓蒸汽滅菌原料充分，制作簡便，價格低廉，可反復使用現(xiàn)在是44頁\一共有120頁\編輯于星期二現(xiàn)在是45頁\一共有120頁\編輯于星期二與微載體結合的生物反應器系統(tǒng)現(xiàn)在是46頁\一共有120頁\編輯于星期二現(xiàn)在是47頁\一共有120頁\編輯于星期二優(yōu)點：1)表面積／體積比大；2)把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點；3)培養(yǎng)基利用率高；4)簡化了細胞生長各種環(huán)境因素的檢測和控制，采樣重演性好；5)可用簡單的顯微鏡觀察細胞在微珠表面的生長情況；6)收獲過程不復雜；7)放大較容易；8)勞動強度小；9)培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。現(xiàn)在是48頁\一共有120頁\編輯于星期二(4)固定化培養(yǎng)概念：用物理、化學方法將細胞固定在載體介質上，然后進行懸浮培養(yǎng)。應用：貼壁依賴性和非貼壁依賴性細胞。優(yōu)點：細胞密度高、抗剪切力和污染，生產(chǎn)首選方法：共價交聯(lián)：雙功能試劑處理，細胞之間交聯(lián)。吸附：物理吸附使細胞貼附在固體載體表面。包埋：細胞包埋在載體內部。微囊法：親水半透膜把細胞包埋在微囊內?，F(xiàn)在是49頁\一共有120頁\編輯于星期二生物反應器必備條件制造生物反應器所采用的一切材料，尤其是與培養(yǎng)基、細胞直接接觸的材料，對細胞必須是無毒性的生物反應器的結構必須使之具有良好的傳質、傳熱和混合的性能密封性能良好，可避免一切外來的不需要的微生物的污染對培養(yǎng)環(huán)境中多種物理化學參數(shù)能自動檢測和調節(jié)控制，控制的精確度高，能保持環(huán)境質量的均一(1)動物細胞生物反應器的類型5.動物細胞培養(yǎng)的設備與技術現(xiàn)在是50頁\一共有120頁\編輯于星期二可長期連續(xù)運轉容器加工制造時要求內面光滑，無死角，以減少細胞或微生物的沉積拆裝、連接和清潔方便，耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修設備成本盡可能低生物反應器必備條件現(xiàn)在是51頁\一共有120頁\編輯于星期二按規(guī)模大小可分為：實驗室規(guī)模：＜20L，用于培養(yǎng)工藝的研究;中試規(guī)模：20~100L，提供一定量的產(chǎn)品，供純化、臨床前的各種檢測和臨床觀察，也包括進一步的工藝優(yōu)化實驗;生產(chǎn)規(guī)模：＞100L，用于生產(chǎn)，提供產(chǎn)品?，F(xiàn)在是52頁\一共有120頁\編輯于星期二攪拌罐式生物反應器氣升式生物反應器透析袋或膜式生物反應器中空纖維生物反應器固定床或流化床式生物反應器類型：現(xiàn)在是53頁\一共有120頁\編輯于星期二機械攪拌式生物反應器現(xiàn)在是54頁\一共有120頁\編輯于星期二罐培養(yǎng)的技術要點1、培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)系統(tǒng)：基本上與微生物相似，但有些特殊要求。①攪拌槳葉的形狀（海輪或傾斜葉片）和攪拌轉速（40－50rpm

）要有特殊設計。②培養(yǎng)系統(tǒng)必須保持長期無菌狀態(tài)（系統(tǒng)密封性；抗生素）。③培養(yǎng)罐、配管的材質必須要對培養(yǎng)的細胞無毒害作用（通常采用不銹鋼）。2、培養(yǎng)條件的控制：可采用分批、流加、半連續(xù)和連續(xù)，微載體培養(yǎng)只能用分批培養(yǎng)法；培養(yǎng)溫度、溶解氧、pH、罐壓、攪拌轉速等也要控制，而且控制的精確度要更高。現(xiàn)在是55頁\一共有120頁\編輯于星期二氣升式生物反應器現(xiàn)在是56頁\一共有120頁\編輯于星期二其中關鍵的是一個籠式撐拌器?；\式通氣裝置的特點主要是可以避免在向培養(yǎng)基中通氣時，氣泡直接損傷細胞（因為氣泡已被上部的200目絲網(wǎng)機械地破壞了。氣腔式反應器（懸浮培養(yǎng)或微載體培養(yǎng)用）現(xiàn)在是57頁\一共有120頁\編輯于星期二

與攪拌式生物反應器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和營養(yǎng)的傳遞好，由于沒有了機械攪拌的結構，有利于設備的密封，降低了造價。高徑比一般在10：1左右。現(xiàn)在是58頁\一共有120頁\編輯于星期二中空纖維反應器現(xiàn)在是59頁\一共有120頁\編輯于星期二中空纖維反應器：左右兩箭頭為無菌空氣進出口。細胞生長在由半透性的多孔膜制成的中空纖維的外表面。中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)現(xiàn)在是60頁\一共有120頁\編輯于星期二由數(shù)百乃至數(shù)千根中空纖維集束組成的反應器，纖維的材料為聚砜或丙烯共聚物，纖維壁厚為50-100m，呈多孔性，內層為超濾膜，內腔直徑為200m，兩端用環(huán)氧樹脂等材料將纖維粘和在一起，并使內腔開口于外加的塑料圓筒，使形成兩個隔開的腔。①不能重復使用；②不能耐受高壓滅菌，需用環(huán)氧乙烷或其它消毒劑滅菌；③難以取樣檢測?，F(xiàn)在是61頁\一共有120頁\編輯于星期二在中空纖維生物反應器中就形成了兩個空間：一是“內室”，即纖維管內空間，可灌流無血清培養(yǎng)液供細胞生長；二是“外室”，即纖維管與管之間的間隙；細胞接種到外室，細胞貼附在外室的管壁上，并迅速吸取從內室滲透出來的養(yǎng)分，迅速生長繁殖?，F(xiàn)在是62頁\一共有120頁\編輯于星期二膜式生物反應器現(xiàn)在是63頁\一共有120頁\編輯于星期二在動物細胞培養(yǎng)過程中，會產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，如乳酸和氨等，對細胞的生長和產(chǎn)物的產(chǎn)生會產(chǎn)生抑制作用，因此有些學者設計了透析袋或膜式反應器，它們可將這些有害代謝產(chǎn)物透析或過濾掉，從而使細胞生長至更高密度，同時可根據(jù)需要選用不同相對分子質量的膜，使產(chǎn)物保留在膜內或與細胞分離開?，F(xiàn)在是64頁\一共有120頁\編輯于星期二現(xiàn)在是65頁\一共有120頁\編輯于星期二結構較簡單，裝填的材料可以是一切對細胞無毒、又有利于細胞貼附的材料，有實心載體和有孔載體兩類。現(xiàn)在是66頁\一共有120頁\編輯于星期二Wave搖袋式細胞培養(yǎng)生物反應器現(xiàn)在是67頁\一共有120頁\編輯于星期二現(xiàn)在是68頁\一共有120頁\編輯于星期二現(xiàn)在是69頁\一共有120頁\編輯于星期二現(xiàn)在是70頁\一共有120頁\編輯于星期二（2）動物細胞培養(yǎng)的操作方式分批式操作補料-分批（或流加式）操作（細菌生產(chǎn)中常用）半連續(xù)式操作連續(xù)式操作（個別情況下用于懸浮細胞的培養(yǎng)）灌流式操作現(xiàn)在是71頁\一共有120頁\編輯于星期二灌流式操作定義：當細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時不斷地補充新鮮培養(yǎng)基。但細胞留在反應器內，使細胞處于一種不斷的營養(yǎng)狀態(tài)。現(xiàn)在是72頁\一共有120頁\編輯于星期二細胞可處在較穩(wěn)定的良好的環(huán)境中，營養(yǎng)條件好，有害代謝廢物濃度低；可極大地提高細胞密度，從而極大地提高了產(chǎn)品產(chǎn)量；產(chǎn)品在罐內停留時間縮短，可及時收留在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質量的提高；培養(yǎng)基的比消耗率較低，加之產(chǎn)量質量的提高，生產(chǎn)成本明顯降低。灌流式操作的優(yōu)點現(xiàn)在是73頁\一共有120頁\編輯于星期二動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等（3）大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的問題及對策

①優(yōu)化細胞培養(yǎng)環(huán)境②改變細胞特性③提高產(chǎn)品的產(chǎn)率現(xiàn)在是74頁\一共有120頁\編輯于星期二①細胞培養(yǎng)環(huán)境細胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提高細胞密度的主要限制因素。體外動物細胞培養(yǎng)中氨離子的積累是抑制細胞生長的主要因素之一。氨的積聚使細胞內UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影響細胞的生長及蛋白的糖基化過程?，F(xiàn)在是75頁\一共有120頁\編輯于星期二②細胞死亡與凋亡

最近研究顯示在大規(guī)模培養(yǎng)生物反應器中細胞的死亡中80%是凋亡所導致，而不是以前所認為的壞死。而在大規(guī)模細胞培養(yǎng)中，細胞死亡是維持細胞高活性和高密度的最大障礙。細胞凋亡/死亡多是在營養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多時發(fā)生。因此，理論上講，防止或延長細胞死亡或使其處于一種“細胞靜止”過程可以有效降低營養(yǎng)成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生，有利于提高細胞的培養(yǎng)密度、延長細胞的培養(yǎng)周期，從而提高目標產(chǎn)品的產(chǎn)量?，F(xiàn)在是76頁\一共有120頁\編輯于星期二a）營養(yǎng)物質抗凋亡

在常規(guī)生物反應器構造中，營養(yǎng)耗竭或缺乏培養(yǎng)基中特殊的生長因子則引起凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗盡。培養(yǎng)基中添加氨基酸或其它關鍵營養(yǎng)可抑制凋亡、延長培養(yǎng)時間從而提高產(chǎn)品的生產(chǎn)。大規(guī)模培養(yǎng)中細胞凋亡主要由于營養(yǎng)物質的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補加谷氨酰胺已不能逆轉凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，細胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡?，F(xiàn)在是77頁\一共有120頁\編輯于星期二b）基因抗凋亡

與凋亡相關的一系列基因產(chǎn)物可對其進行正、負向的調控，因此可通過導入相應基因來調節(jié)細胞凋亡的機制。Bcl-2基因是目前最為有效的抗凋亡基因，在多種細胞系中均表現(xiàn)出很強的抗凋亡活性。此外，向CHO細胞（中國倉鼠卵巢細胞）中導入p21、p27的基因，使細胞周期中G1期延長（細胞靜止），改造后，細胞活力正常，外源基因表達蛋白量提高。其優(yōu)點是產(chǎn)品成本降低，產(chǎn)量提高，遺傳一致性高。

現(xiàn)在是78頁\一共有120頁\編輯于星期二c）化學方法抗凋亡

凋亡發(fā)生時細胞許多部位發(fā)生生化物質的改變，有些變化如改變細胞氧化還原條件產(chǎn)生活性氧在凋亡信號階段發(fā)生，其它的如破壞線粒體膜電位、激活caspase則發(fā)生在凋亡效應階段，這在絕大多數(shù)細胞死亡中是相同的。因此，阻止這些生化物質的改變可能阻止或至少延遲細胞凋亡的發(fā)生，運用化學物質可抑制信號效應階段的發(fā)生，被認為是抗調亡策略之一?，F(xiàn)在是79頁\一共有120頁\編輯于星期二③培養(yǎng)基與細胞系無血清培養(yǎng)基成為當今細胞培養(yǎng)領域研究的一大課題。無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于避免了血清的批次、質量、成分等對細胞培養(yǎng)造成的污染、毒性作用和不利于產(chǎn)品純化等不良影響。在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物制品的應用領域中，優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的成分可使不同的細胞在最有利于細胞生長和表達目的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。但無血清培養(yǎng)基并不適用于廣泛的細胞類型，不同類型的細胞甚至不同的細胞系或細胞株都有可能有各自的無血清培養(yǎng)基構成?，F(xiàn)在是80頁\一共有120頁\編輯于星期二④過程監(jiān)控大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)中由于大量細胞的代謝，細胞培養(yǎng)環(huán)境迅速改變，在線過程監(jiān)控更為重要?，F(xiàn)在是81頁\一共有120頁\編輯于星期二第三節(jié)動植物細胞的組織培養(yǎng)二、植物組織細胞培養(yǎng)組織培養(yǎng)：將植物的部分組織和器官切下，進行表面消毒殺菌，在一定培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，用于獲得種苗、新的組織和器官或者生產(chǎn)生物藥物。目前，組織培養(yǎng)技術已經(jīng)進行的生產(chǎn)：珍惜植物愈傷組織幼苗；生物堿；皂甙；色素等等，植物的次級代謝物優(yōu)點：不受氣候影響；可以人工控制，目的產(chǎn)物的獲取有針對性；可以進行定向的生物轉化植物組織培養(yǎng)主要用于珍惜植物種苗的繁殖和次生代謝產(chǎn)物的獲得?，F(xiàn)在是82頁\一共有120頁\編輯于星期二①人為控制條件，克服人工栽培的不足；②不受季節(jié)氣候的影響，不需占用大量耕地；③可以排除病蟲害的侵擾；④可以進行特定的生物轉化，克服化學合成的缺點。用植物組織培養(yǎng)進行生產(chǎn)優(yōu)點：現(xiàn)在是83頁\一共有120頁\編輯于星期二植物細胞培養(yǎng)的特性：1.植物細胞較微生物細胞大得多，有纖維素細胞壁。細胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；2.培養(yǎng)過程生長速度緩慢，易受微生物污染，需用抗生素；3.細胞生長的中期及對數(shù)期，易凝聚為直徑達0.4mm的團塊，懸浮培養(yǎng)較難；4.培養(yǎng)時需供氧，培養(yǎng)液粘度大，能耐受通風攪拌；現(xiàn)在是84頁\一共有120頁\編輯于星期二植物細胞培養(yǎng)的特性：5.具有群體效應、無錨地依賴性及接觸抑制性；6.因為有細胞壁，培養(yǎng)細胞產(chǎn)物滯留于細胞內，產(chǎn)量較低；7.細胞培養(yǎng)過程具有結構與功能全能性，因而易分化，從而導致目的產(chǎn)物低于原植物體內的濃度；8.懸浮培養(yǎng)中要求有一定的細胞濃度，否則不生長（25000～50000個/mL）。

現(xiàn)在是85頁\一共有120頁\編輯于星期二植物細胞培養(yǎng)流程一般為：細胞株的建立：愈傷組織的培養(yǎng)，分離出單細胞的優(yōu)良無性繁殖體系經(jīng)搖瓶獲得種子，擴大種子培養(yǎng)放大培養(yǎng)現(xiàn)在是86頁\一共有120頁\編輯于星期二現(xiàn)在是87頁\一共有120頁\編輯于星期二紫草寧細胞培養(yǎng)效果進行愈傷組織的培養(yǎng)，并將從愈傷組織中分離出單細胞，進行優(yōu)良的細胞株選擇，建立無性繁殖細胞系，經(jīng)培養(yǎng)獲得的游離細胞擴大培養(yǎng)作為種子供大規(guī)模發(fā)酵使用。目前采用植物細胞培養(yǎng)技術進行的植物次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，其產(chǎn)量都高于原來植物體中的代謝物含量，如：小檗堿，冬蟲夏草，紫草素等?，F(xiàn)在是88頁\一共有120頁\編輯于星期二一般的植物細胞培養(yǎng)采用深層液體培養(yǎng)，營養(yǎng)成分除了碳氮源，無機鹽以外，還包括各種生長因子（維生素）和植物生長調節(jié)劑（隨生產(chǎn)產(chǎn)物的不同而改變）（煙草細胞培養(yǎng)基RM-1962）由于植物細胞的特殊性質，振蕩或攪拌培養(yǎng)時需要控制特定的轉速和培養(yǎng)溫度：振蕩培養(yǎng)振蕩頻率100左右偏心距4cm左右；攪拌轉速100rpm以下；培養(yǎng)溫度都在30℃以下（對于愈傷組織和細胞培養(yǎng)的溫度，應視不同植物來源而不同）。培養(yǎng)條件現(xiàn)在是89頁\一共有120頁\編輯于星期二植物細胞培養(yǎng)需要解決的問題及基本方法問題包括：①氧和二氧化碳的控制，過多氧過少氧均不利于生長；②營養(yǎng)物的供應，同動物細胞；③細胞密度過高引起細胞團聚甚至分化；④培養(yǎng)過程中細胞的分化的防止；⑤細胞取得中微生物的去除；⑥細胞壁脆性的存在要求培養(yǎng)體系剪切力要小?；竟に囃瑯涌煞譃椋悍峙囵B(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)（恒化培養(yǎng)）和固定化培養(yǎng)。培養(yǎng)反應器可分為通氣攪拌式、鼓泡式、氣升式等。實驗室小規(guī)?？捎脫u瓶、平板、微室等?，F(xiàn)在是90頁\一共有120頁\編輯于星期二工藝過程例現(xiàn)在是91頁\一共有120頁\編輯于星期二第四節(jié)固定化細胞發(fā)酵一、概述細胞固定化技術-----是酶固定化技術的延伸，固定化細胞可稱為第二代固定化酶。方法：吸附、交聯(lián)、共價結合、包埋固定化酶-----是被固定在某一有限空間內不再能自由流動而仍有催化活性的酶。固定化酶優(yōu)點：不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；可反復使用；可連續(xù)化生產(chǎn)；穩(wěn)定性好。固定化酶缺點：固定化過程中往往會引起酶的失活?，F(xiàn)在是92頁\一共有120頁\編輯于星期二固定化細胞與固定化酶相比，具有以下優(yōu)點①可以免除酶的提取和精制；②固定化細胞系統(tǒng)對外界條件(如pH)變化的敏感性不強，故有利于控制反應；③允許有高負荷的載體，而載有固定化酶的載體，由于蛋白-蛋白之間的相互作用，可使酶活下降；④如果反應系統(tǒng)需要許多酶和輔因子再生，固定化細胞則更適合。

現(xiàn)在是93頁\一共有120頁\編輯于星期二固定化技術1.吸附法①物理吸附②離子吸附2.包埋法①格子型包埋②微膠囊型包埋3.通過雙功能試劑進行共價交聯(lián)4.和水不溶性載體共價結合包埋法具有使用的普遍性，主要包埋劑有：海藻酸鈉－CaCl2，瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，卡拉膠等；微膠囊法：采用半透膜包裹細胞?，F(xiàn)在是94頁\一共有120頁\編輯于星期二包埋法：將細胞包埋在多孔載體內部制成固定化細胞的方法。優(yōu)點：步驟簡單，條件溫和，負荷量大，細胞泄露少，抗機械剪切?，F(xiàn)在是95頁\一共有120頁\編輯于星期二包埋法缺點：擴散限制，并非所有的細胞處于最佳基質濃度，且大分子基質不能滲透到高聚物網(wǎng)絡內部。一般適用于非貼壁依賴性細胞的固定。常用的載體：瓊脂糖；海藻酸鈣凝膠現(xiàn)在是96頁\一共有120頁\編輯于星期二取0.6ｇ海藻酸鈉溶于25ml無菌水,加熱溶解后,冷卻，靜置1h消泡；取5ml菌懸液搖勻倒入，再加無菌水30ml使海藻酸鈉的最終濃度2%,將海藻酸鈉與5ml菌懸液混合勻；用5ml注射器滴入100ml4%CaCl2溶液中,交聯(lián)固定12h。濾出固定化顆粒用生理鹽水洗凈。海藻酸鈉包埋法現(xiàn)在是97頁\一共有120頁\編輯于星期二瓊脂凝膠包埋法稱取1.5ｇ瓊脂溶于25ml水中，加熱溶解后加無菌水至25ml混勻,冷卻到55℃,將5ml菌懸液搖勻倒入混合均勻,立即將瓊脂與聚磷菌的混合物倒入無菌培養(yǎng)皿中,過夜，然后切成3×3×3mm的小方塊，用生理鹽水洗凈?，F(xiàn)在是98頁\一共有120頁\編輯于星期二微囊法：用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊內，細胞不能溢出，但小分子物質及營養(yǎng)物質可自由出入半透膜。囊內是微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護細胞少受損傷，故細胞生長好、密度高?，F(xiàn)在是99頁\一共有120頁\編輯于星期二

微囊法在動物細胞微囊化的制備中，主要是應用海藻酸—聚氨基酸的方法:動物細胞與海藻酸鈉溶液混合攪拌，經(jīng)過微囊發(fā)生器將微球滴入氯化鈣溶液中。海藻酸鈣不溶于水，形成凝膠，然后再用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，最后用檸檬酸處理去除微球內的鈣離子，使球內的海藻酸成液態(tài)，動物細胞得以懸浮在其中。海藻酸和聚氨基酸是關鍵材料?，F(xiàn)在是100頁\一共有120頁\編輯于星期二細胞懸浮液海藻酸鈉溶液海藻酸鈣凝膠動物細胞CaCl2溶液微囊發(fā)生器

聚賴氨酸檸檬酸納溶液

微囊(動物細胞)具膜微囊溶液動物細胞膜動物細胞微囊的制備過程示意圖現(xiàn)在是101頁\一共有120頁\編輯于星期二聚賴氨酸和殼聚糖聚賴氨酸：在以海藻酸鈉為基質的微膠囊研究中幾乎都采用它制備囊膜，但是聚賴氨酸價格十分昂貴(300～400$/g)。殼聚糖(CS)：源于甲殼素，含大量伯氨基。能與海藻酸鈉等陰離子聚電解質反應成膜，可作為聚賴氨酸的替代物。現(xiàn)在是102頁\一共有120頁\編輯于星期二微囊直徑控制在200-400μm為宜。制備中應注意：

●溫和、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作；

●所用試劑和膜材料對細胞無毒害；

●膜的孔徑可控制，必須使營養(yǎng)物和代謝物自由通過；

●膜應有足夠機械強度抵抗培養(yǎng)中攪拌。

現(xiàn)在是103頁\一共有120頁\編輯于星期二使用固定化細胞發(fā)酵的優(yōu)點：①分批發(fā)酵可用固定化細胞進行連續(xù)反應來代替；②可以利用高密度的固定化細胞集合體進行發(fā)酵，反應效率大大提高；③可以人為地控制固定化細胞的生理狀態(tài)，因為許多代謝產(chǎn)物(或酶)僅僅在細胞的靜止期才能形成，所以有利于產(chǎn)物的形成。發(fā)酵液的體積也大大減小?，F(xiàn)在是104頁\一共有120頁\編輯于星期二二、理想的固定化細胞制備方法的特點①能夠控制固定化細胞的大小和孔隙度；②固定化所使用的原料應該便宜、易得，成本應盡量低；③固定化方法簡便、易行，過程溫和，盡量少損傷細胞；④具有穩(wěn)定網(wǎng)狀結構，在所使用的pH和溫度下，不會被破壞；⑤固定化細胞應具有良好的機械穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性；⑥所用載體，對細胞應該是惰性的，即不損傷細胞；⑦底物、產(chǎn)物和其他代謝產(chǎn)物能夠自由擴散，降低產(chǎn)物和其他代謝產(chǎn)物對細胞酶反應的抑制；⑧單位體積的固定化細胞應該擁有盡可能多的細胞，當使用固定化活細胞時，更有此需要。

現(xiàn)在是105頁\一共有120頁\編輯于星期二固定化細胞有3種不同的生理狀態(tài)：①固定化后是死細胞，這種狀態(tài)只適用于一種酶催化的反應；②固定化后的細胞生活力不確定，這種狀態(tài)通常用于一種酶或少數(shù)幾種酶所催化的反應；③固定化后是活細胞，這種狀態(tài)適用于多酶反應，特別是需要輔酶的反應。

現(xiàn)在是106頁\一共有120頁\編輯于星期二現(xiàn)在是107頁\一共有120頁\編輯于星期二三、固定化生物反應器按其用途可分為三類：①生物轉化反應器，多用于死細胞或不再生長繁殖的細胞。不供氧，不排CO2；②產(chǎn)物的生成與細胞的生長無關的生物反應器，適用于處在生長狀態(tài)的細胞，有利于細胞的生長和產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，需或不需供氧，但須供給維持細胞生理活動和合成產(chǎn)物所需要的營養(yǎng)物；③生產(chǎn)初級代謝產(chǎn)物的反應器，必須符合細胞生長的需要并供給充足的營養(yǎng)物，良好通氣，并排出生成的CO2，須控制細胞的濃度，以便在恒定的條件下進行操作。

現(xiàn)在是108頁\一共有120頁\編輯于星期二三、固定化生物反應器現(xiàn)有的常用固定化細胞生物反應器有：連續(xù)攪拌罐反應器、填充床反應器、流化床反應器、膜反應器、轉盤式生物反應器和其他類型反應器等?，F(xiàn)在是109頁\一共有120頁\編輯于星期二固定化細胞膜反應器最常用的膜反應器是中空纖維和螺線式卷繞反應器。在中空纖維反應器中，細胞既可處于纖維管中，又可處于管外，螺線式卷繞膜反應器實質上是卷成圓筒形的平板反應器?，F(xiàn)在是110頁\一共有120頁\編輯于星期二固定化細胞膜反應器現(xiàn)在是111頁\一共有120頁\編輯于星期二膜反應器膜反應器的優(yōu)點是可以重復使用。因此，盡管投資放大，重復使用使這種形式的固定化反應器比較經(jīng)濟?，F(xiàn)在是112頁\一共有120頁\編輯于星期二（1）

aa的生產(chǎn)：L－天冬氨酸（具有高活性酶的大腸肝菌）6.固定化細胞的應用（2）抗生素的生產(chǎn)：6-氨基青霉烷酸（6－APA）青霉素?；脯F(xiàn)在是113頁\一共有120頁\編輯于星期二（3）活性蛋白藥物的生產(chǎn)：主要由動物固定化細胞進行生產(chǎn)，包括單抗，干擾素，白介素，生長因子等。目前利用基因工程技術構建工程菌可以進行小型連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)