谷物種子蛋白質(zhì)中賴氨酸含量的測定

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一、試驗?zāi)康?/p>

把握茚三酮比色法測定氨基酸含量的原理和方法,測定谷物種子蛋白質(zhì)中賴氨酸含量。

二、試驗原理

蛋白質(zhì)中的賴氨酸具有一個游離的ε-NH2，它與茚三酮試劑反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與賴氨酸的含量成線性關(guān)系。因此，用已知濃度的游離氨基酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過比色分析（530nm）即可測定出樣品中的賴氨酸含量。

亮氨酸與賴氨酸的碳原子數(shù)目一致，而且僅有—個游離氨基(ε-NH2)，所以尋常用亮氨酸配制標(biāo)準(zhǔn)液。但由于這兩種氨基酸分子質(zhì)量不同，以亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)計算賴氨酸含量時，應(yīng)乘以校正系數(shù)1.1515，最終再減去樣品中游離氨基酸含量。三、試驗儀器

1．電子分析天平（1/1000）、可見分光光度計、恒溫水浴箱、枯燥器、移液器。

2．試管架（塑及鋁）、具塞試管、具塞三角瓶、細(xì)口瓶、漏斗（或0.45um濾膜）、吸管等。四、試驗試劑

1．0.4mol/L檸檬酸緩沖液：稱取4.202g檸檬酸和5.88g檸檬酸三鈉，溶于100ml蒸餾水中。

2．茚三酮試劑：稱40mg二氯化錫(防腐)溶于25ml檸檬酸緩沖液中；稱lg茚三酮溶于25ml95％乙醇中；將上述兩液混合搖勻，濾去沉淀，上清液置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3．0.02mol/L鹽酸：取12mol/L鹽酸0.17ml，用蒸餾水稀釋定容至100ml。4．亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)液：確鑿稱取20mg亮氨酸，加數(shù)滴0.02mol/L鹽酸使之溶解，然后用蒸餾水稀釋定容到100ml，則得濃度為200μg／ml的標(biāo)準(zhǔn)液。5．60％乙醇。

6．4％碳酸鈉：稱取4g無水碳酸鈉，溶于100ml蒸餾水。7．2％碳酸鈉。

五、操作步驟1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。取7支具塞試管，按表進(jìn)行編號、參與試劑，順序操作。以第1管為空白，在530nm波長下比色，讀取吸光度值。并以吸光度值為縱坐標(biāo)，亮氨酸含量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2．樣品前處理不同品種的玉米種子，用粉碎機粉碎，過80～100目篩子，收集過篩后的細(xì)粉，放入廣口瓶中，參與沸程60～90℃的石油醚，使其淹過粉面，浸泡8小時，不時搖動進(jìn)行脫脂。然后過濾，并用石油醚淋洗沉淀若干次，棄去濾液。將脫脂玉米粉涼在清白的濾紙上，置陰涼通風(fēng)處吹干石油醚。收集干粉，置于枯燥器內(nèi)，保存?zhèn)溆谩?．樣品的測定取15mg已粉碎脫脂的玉米樣品于具塞枯燥試管內(nèi)，加2％碳酸鈉1.0ml，于80℃水浴中提取20min，然后加茚三酮試劑2.Oml，繼續(xù)保溫顯色30min，冷卻后加60％乙醇3.Oml，混勻后過濾或離心，然后在530nm波長下比色。六、試驗結(jié)果樣品中賴氨酸的含量（%）=[從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得值（μg）×10-3/(樣品重mg)]×1.1515×100%-C校正系數(shù)：1.1515；C：游離的氨基酸含量七、本卷須知1．各種作物種子中游離氨基酸含量是：玉米0.01％、小麥0.05％、水稻0.01％、高糧0.04％。2．茚三酮顯色反應(yīng)受溫度、pH、時間影響較大，假使要使試驗結(jié)果能很好重復(fù)，必需嚴(yán)格控制上述條件。樣品中如含有大量鹽酸會使氨基酸不易顯色。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品測定參考表試管號試劑1#(空白)2#3#亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(ml)00.10.2蒸餾水(ml)0.50.40.3亮氨酸含量(μg)020404％碳酸鈉(ml)0.50.50.5脫脂樣品(mg)／／／2％碳酸鈉(ml)／／／／／／4#0.30.2600.5／／／5#0.40.1800.5／／／6#0.501000.5／／／7#(樣品)／／／／151.080℃水浴20分鐘茚三酮試劑(ml)60％乙醇(ml)2.03.0／混勻2.03.0／2.03.0／2.03.0／2.03.0／2.03.0／2.03.0過濾混勻，加塞，80℃水浴30分鐘，冷卻至室溫A530

蛋白質(zhì)中賴氨酸（lysine，Lys）的含量是谷物品質(zhì)的主要指標(biāo)之一。由于動物及人類不能合成，須從食物中得以補充，為此培育高含量賴氨酸的谷物，對于提高營養(yǎng)價值有重要意義。本試驗分別用茚三酮溶液顯色法和染料結(jié)合法（DyeBindingLysine，DBL）測玉米種子中賴氨酸含量。

一、茚三酮顯色法原理：谷物蛋白中賴氨酸殘基有自由的ε-NH2，它與茚三酮（ninhydrin）試劑可發(fā)生顏色反應(yīng)，生成紫紅色物質(zhì)，其顏色與賴氨酸殘基的數(shù)目成正相關(guān)。選用碳原子數(shù)目與賴氨酸一致的亮氨酸，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，可用以測定谷物蛋白內(nèi)賴氨酸的含量.

二、材料、儀器設(shè)備

（一）材料：不同品種的玉米種子，用粉碎機粉碎，過100目篩子，收集過篩后的細(xì)粉，放入廣口瓶內(nèi)，參與沸程60～90℃的石油醚，使其淹過粉面，浸泡8h，不時攪動進(jìn)行脫脂。然后過濾，并用石油醚淋洗沉淀若干次，棄去濾液。將脫脂玉米粉晾在清白的濾紙上，置陰涼通風(fēng)處吹干石油醚。收集干粉，置枯燥器內(nèi)，保存?zhèn)溆谩＃ǘ﹥x器設(shè)備：1.722型分光光度計；2.水浴鍋；3.試管；4.圓頭玻璃棒（圓頭大小要與試管大小配套）。

（三）試劑：1.緩沖溶液，稱取30g甲酸鈉，溶解于約60ml蒸餾水中，參與10ml8％的甲酸，最終加水到