腫瘤基因治療基本策略和常用方法

CONTENTS01腫瘤和基因治療的基本概念02腫瘤基因治療的基本策略03基本方法04對(duì)未來腫瘤基因治療的展望腫瘤基因治療的基本策略和常用方法第一頁，共34頁。01腫瘤和基因治療的基本概念第二頁，共34頁。01腫瘤機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。學(xué)界一般將腫瘤分為良性和惡性兩大類。第三頁，共34頁。01基因治療

指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的，腫瘤的基因治療是將目的基因?qū)氚屑?xì)胞,使其在體內(nèi)表達(dá)并發(fā)揮特定的功能,殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞從而達(dá)到治療的目的第四頁，共34頁。02腫瘤基因治療的基本策略第五頁，共34頁。01020304

采用基因打靶技術(shù)矯正突變的抑癌基因中的突變序列基因矯正01將外源性的正常抑癌基因直接導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，取代突變的抑癌基因而發(fā)揮作用，以改變腫瘤細(xì)胞的惡性表型基因置換02

利用基因干擾技術(shù)等抑制異常表達(dá)的癌基因或腫瘤相關(guān)基因，降低其表達(dá)活性或使其不表達(dá)03基因失活GO!YEAH!基因修飾04又稱基因轉(zhuǎn)移，是指將外源性目的基因?qū)氚┳兗?xì)胞，通過目的基因表達(dá)產(chǎn)物修飾缺陷細(xì)胞，使其恢復(fù)功能或原有功能得到加強(qiáng)基因型修飾是應(yīng)用最廣泛的一個(gè)策略。第六頁，共34頁。03常用方法第七頁，共34頁。0104031、基因干預(yù)技術(shù)2、自殺基因治療3、腫瘤的免疫基因治療4、提高化學(xué)治療效果的輔助基因治療02第八頁，共34頁。1、基因干預(yù)技術(shù)（1）反義RNA技術(shù)

如何獲得反義RNA：①體外構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體，將其導(dǎo)入腫瘤

細(xì)胞并表達(dá)反義RNA

②體外合成反義RNA，將其導(dǎo)入靶細(xì)胞，對(duì)表

達(dá)異常的癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制效應(yīng)。第九頁，共34頁。1、基因干預(yù)技術(shù)反義RNA技術(shù)在基因治療中需解決的首要問題：

①專一性轉(zhuǎn)移問題：如何專一性的對(duì)病灶處病變的細(xì)胞進(jìn)行處

理，而不影響其它正常細(xì)胞

②反義RNA在進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問題：反義RNA抗RNase的

能力不強(qiáng)

③安全性問題

第十頁，共34頁。1、基因干預(yù)技術(shù)受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移技術(shù)

受體介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬作用：細(xì)胞膜上存在一些專一性受體是組織或器官特異的，這些受體專一性的與相應(yīng)配體結(jié)合后，所形成的受體配體復(fù)合物就會(huì)在細(xì)胞膜上某些特定區(qū)域富集，通過細(xì)胞吞噬作用，實(shí)現(xiàn)這些配體向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移

特點(diǎn)：①具有細(xì)胞、組織或器官專一性，配體

只能被一些特異的細(xì)胞吞噬

②配體進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)移效率很高脫唾液酸血清類黏蛋白（ASGP）受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移第十一頁，共34頁。1、基因干預(yù)技術(shù)反義DNA技術(shù)治療腫瘤的三個(gè)設(shè)想：

①封閉異常表達(dá)的癌基因

②癌基因的異位和重排部位是反義RNA治療的理想目標(biāo)

③抑制腫瘤細(xì)胞耐藥性，從而提高化學(xué)治療效果第十二頁，共34頁。1、基因干預(yù)技術(shù)⑵、RNA干擾技術(shù)

RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的,由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。RNAi使特定基因沉默,是真核細(xì)胞中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制,這種由21~23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度介導(dǎo)的小RNA常被稱為小干擾RNA(siRNA),其序列在真核生物進(jìn)化中高度保守。將長(zhǎng)dsRNA或短siRNA遞送進(jìn)入生物體細(xì)胞內(nèi)均可引發(fā)RNAi，進(jìn)而使特定基因表達(dá)沉默基于RNAi的腫瘤治療應(yīng)用于臨床,有兩個(gè)關(guān)鍵問題亟需解決:首先,如何高效向腫瘤細(xì)胞或組織遞送干擾RNA;其次,如何減少外源性siRNA引起的不良反應(yīng)。第十三頁，共34頁。1、基因干預(yù)技術(shù)RNAi作用機(jī)制①病毒基因、轉(zhuǎn)座子、人工轉(zhuǎn)入基因等外源基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi),并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)常產(chǎn)生一些dsRNA。②

siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈,然后由反義鏈與胞內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物

（RISC）③此時(shí)RISC具有核酸酶的功能,能在結(jié)合部位切割mRNA,切割位點(diǎn)是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解,進(jìn)而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mRNA的降解反應(yīng)

第十四頁，共34頁。1、基因干預(yù)技術(shù)RNAi理想遞送系統(tǒng)

①適配體——RNAi的嵌合體。適配體能與多種目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性結(jié)合②穩(wěn)定核酸脂質(zhì)復(fù)合物（SNALPs），對(duì)脂類復(fù)合物進(jìn)行聚乙二醇（PEG）修飾使得復(fù)合物獲得親水性外層，從而增強(qiáng)其在血漿中的穩(wěn)定性如何高效地向腫瘤細(xì)胞或組織遞送干擾RNA?第十五頁，共34頁。1、基因干預(yù)治療如何解決RNAi存在的安全問題?1、克服siRNA的脫靶問題siRNA可引起一些非靶基因的特異性沉默或表達(dá)上調(diào)，引起細(xì)胞凋亡或生長(zhǎng)抑制，這種現(xiàn)象叫做脫靶效應(yīng)

解決脫靶效應(yīng)的潛在方法：⑴最新發(fā)現(xiàn)的siRNA領(lǐng)域轉(zhuǎn)移優(yōu)化策略

⑵改變siRNA濃度

⑶siRNA設(shè)計(jì)2、克服RNAi引起的免疫反應(yīng)siRNAs是哺乳動(dòng)物固有免疫系統(tǒng)的有力激活劑，能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素。

解決方法：⑴用免疫刺激的siRNA來避免誘發(fā)的相關(guān)免疫反應(yīng)，通過選擇免疫缺乏刺激基序的序列，設(shè)計(jì)出無免疫刺激活性的siRNA

⑵通過化學(xué)修飾來穩(wěn)定siRNA第十六頁，共34頁。2、自殺基因治療基本原理：向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入某些真核細(xì)胞中不存在的酶基因，這些基因表達(dá)的特異性酶可以催化對(duì)真核細(xì)胞無毒或低毒的藥物前提，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种坪怂岷铣尚?yīng)的抗代謝藥物，進(jìn)而選擇性的地使轉(zhuǎn)染了該基因的腫瘤細(xì)胞“自殺”。旁觀者效應(yīng)：導(dǎo)入有自殺基因的腫瘤細(xì)胞對(duì)鄰近的未導(dǎo)入自殺基因的腫瘤細(xì)胞有殺傷作用?？擅黠@擴(kuò)大自殺基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的殺傷作用基本步驟：⑴尋找具有治療意義的目的基因

⑵建立向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移目的基因的載體系統(tǒng)

⑶目的基因在靶細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，達(dá)到治療目的第十七頁，共34頁。2、自殺基因治療⑴、常見的自殺基因系統(tǒng)①tk-GCV系統(tǒng)病毒、細(xì)菌、真核細(xì)胞中都存在胸苷激酶（HSV-tk）。甘昔洛韋(GCV)是臨床上用于治療單純皰疹的藥物。GCV在胸苷激酶的作用下生成三磷酸GCV，能阻斷DNA合成產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。②CD-5-FC系統(tǒng)胞嘧啶脫氨酶基因(CD)存在于許多細(xì)菌和真菌中，5-氟胞嘧啶(5-FC)在微生物體內(nèi)被CD代謝成5-氟尿嘧啶，后者有明顯的抗腫瘤活性。目前應(yīng)用最廣泛的是大腸桿菌的CD基因。

第十八頁，共34頁。2、自殺基因治療⑵、自殺基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)Ⅰ、載體技術(shù)①病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移：以其高轉(zhuǎn)染率和良好的靶向性成為腫瘤治療中應(yīng)用最廣泛的方法，其中包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒②非病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移：常用的非病毒載體有脂質(zhì)體及多聚陽離子聚合物，具有低免疫、低毒性、無基因插片段大小限制等優(yōu)勢(shì)，但缺乏組織的特異性和靶向性，轉(zhuǎn)染效率低且易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，基因表達(dá)時(shí)間第十九頁，共34頁。2、自殺基因治療Ⅱ、增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

自殺基因治療要求轉(zhuǎn)染的自殺基因要有一定的表達(dá)效率，同時(shí)能選擇性的表達(dá)于靶細(xì)胞中，從而最大限度的殺傷腫瘤細(xì)胞。目前主要的靶向方法有：①靶向性轉(zhuǎn)導(dǎo)

載體攜帶外源基因,在一定的反應(yīng)環(huán)境中作用于靶細(xì)胞,完成基因轉(zhuǎn)移這一過程中,無論是載體、環(huán)境因素還是靶細(xì)胞的改變都將影響基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。惡性腫瘤細(xì)胞常有表面受體的異常表達(dá)或腫瘤特異性抗原表達(dá),將載體與腫瘤表面特異表達(dá)、高表達(dá)受體相對(duì)應(yīng)的配體或與相對(duì)應(yīng)抗體相連,將提高外源基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率②靶向性轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)受到多層次的調(diào)控,因此外源基因的表達(dá)調(diào)控可以通過對(duì)多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)來實(shí)現(xiàn)。在自殺基因前端接上腫瘤特異性的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,可以增強(qiáng)外源基因在腫瘤中的特異性表達(dá),以加強(qiáng)自殺基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的特異性殺傷效力,同時(shí)可以降低它對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用

第二十頁，共34頁。3、免疫性基因治療基本策略：根據(jù)免疫學(xué)的理論和技術(shù)，并結(jié)合基因轉(zhuǎn)移和基因表達(dá)調(diào)控等分子生物學(xué)方法，以激發(fā)機(jī)體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細(xì)胞功能為目的的一種腫瘤基因治療方法，主要包括：

細(xì)胞因子基因治療和抗體抗原基因治療第二十一頁，共34頁。3、免疫性基因治療3.1

細(xì)胞因子基因治療

原理：細(xì)胞因子基因治療是應(yīng)用分子生物學(xué)方法,將與免疫有關(guān)的細(xì)胞因子編碼基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤或其他免疫效應(yīng)細(xì)胞,使其在機(jī)體表達(dá)，分泌細(xì)胞因子或利用其基因增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性或機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能,進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。第二十二頁，共34頁。3、免疫性基因治療

細(xì)胞因子基因?qū)朊庖咝?yīng)細(xì)胞

將細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILS)或腫瘤特異性殺傷細(xì)胞,再將這些轉(zhuǎn)基因免疫活性細(xì)胞回輸入荷瘤宿主,就能選擇性聚集在腫瘤組織中,產(chǎn)生細(xì)胞因子,提高局部細(xì)胞因子水平,使轉(zhuǎn)基因免疫活性細(xì)胞發(fā)揮較強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)。3.1.2細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤細(xì)胞在體外將編碼細(xì)胞因子的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞,經(jīng)γ射線等處理使失去致癌性,而保存分泌細(xì)胞因子能力,通過細(xì)胞因子生物學(xué)活性,誘導(dǎo)CTL(特異T細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性及抗體產(chǎn)生,增強(qiáng)抗腫瘤免疫。第二十三頁，共34頁。3、免疫基因治療3.2抗原抗體基因治療抗原基因治療原理：將抗原基因?qū)肽[瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫基因治療的設(shè)想，是鑒于許多臨床研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞缺乏主要組織相容性復(fù)合物（MHC）Ⅰ類或Ⅱ類分子的表達(dá)，導(dǎo)致不能將腫瘤抗原運(yùn)輸至細(xì)胞表面，也不能向T細(xì)胞提呈抗原，因而不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的CTL，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。

采用人MHCⅠ類基因HLA-B7進(jìn)行黑色素瘤基因治療，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)同種異體HLA-B7基因，誘導(dǎo)特異性CTL參與的免疫效應(yīng)。第二十四頁，共34頁。3、免疫性基因治療3.2.2抗體基因治療

原理：①抗體可以誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒反應(yīng)，本身具有一定的抗腫瘤效應(yīng)，可直接作用于某些癌基因異常表達(dá)所致的腫瘤。曾有美國(guó)學(xué)者構(gòu)建了一種編碼單鏈抗體的載體(PGT21)，將其轉(zhuǎn)染到CerB2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可以通過細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗CerB2單鏈抗體，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。第二十五頁，共34頁。4、提高化學(xué)治療效果的輔助基因治療4.1藥物增敏基因治療：

原理：將某些藥物增敏基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，使其對(duì)抗腫瘤藥物的敏感

性大大增加。

將雞鈣調(diào)素(CaM)基因?qū)胄∈笕橄侔┘?xì)胞株C127后，應(yīng)用較低劑量的長(zhǎng)春新堿或長(zhǎng)春堿即可抑制該細(xì)胞株的生長(zhǎng)。其原理是，CaM基因的表達(dá)產(chǎn)物作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要物質(zhì)，可明顯增加腫瘤細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿的吸收量而減少排泄量，從而提高了腫瘤細(xì)胞內(nèi)化學(xué)治療藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。第二十六頁，共34頁。4、提高化學(xué)治療效果的輔助基因治療4.2耐藥基因治療①腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生與多種糖蛋白有關(guān)，包括多藥耐藥基因編碼的P-糖蛋白，多藥耐藥相關(guān)蛋白等。為了降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性，可以開發(fā)爭(zhēng)對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生機(jī)制的拮抗劑，如阻斷P-糖蛋白所引發(fā)多藥耐藥的戊脈安。還可以采用基因干擾技術(shù)，在基因水平阻斷耐藥基因的表達(dá)，使腫瘤的多藥耐藥性消失。②針對(duì)化學(xué)治療所致的骨髓細(xì)胞造血功能受到抑制的問題，通過向腫瘤患者的骨髓細(xì)胞導(dǎo)入某種耐藥基因，如mdr-1等基因，以增強(qiáng)骨髓細(xì)胞的抗藥性，以便能耐受大劑量的化學(xué)治療藥物，以達(dá)到徹底殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。第二十七頁，共34頁。04對(duì)未來腫瘤基因治療的展望第二十八頁，共34頁。04對(duì)未來腫瘤基因治療的展望經(jīng)過近30年的發(fā)展,基因治療相關(guān)技術(shù)趨于成熟,若干關(guān)鍵技術(shù)獲得突破。因此,未來幾年將是全球基因治療產(chǎn)品上市的重點(diǎn)時(shí)期,但基因治療應(yīng)用于惡性腫瘤等重大疾病的治療還面臨一些挑戰(zhàn),展望未來基因治療的熱點(diǎn)和亟待解決的科學(xué)問題還有以下幾個(gè)方面

第二十九頁，共34頁。1、基因的體內(nèi)遞送問