利用基因工程技術表達蛋白質(zhì)課件

第四章利用基因工程技術表達蛋白質(zhì)本章的重點內(nèi)容：1.什么是基因工程？2.獲得目的基因的方法有哪些？3.DNA雙脫氧測序技術的基本原理。

4.PCR技術的基本原理及其應用。5.基因定點突變技術及其應用。6.表達載體的構建策略與技術方法。

7.如何根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列獲得其基因？第一節(jié)基因工程原理簡介一、基因工程的定義本義：根據(jù)人們的意愿，利用工程設計的方法，在體外將克隆獲得的目的基因與適當?shù)妮d體進行切割和連接，構建成正確的重組表達載體，再應用物理的、化學的或生物學的方法將該表達載體導入到細菌、動植物細胞或受精卵中，使目的基因在宿主體內(nèi)以瞬時方式或穩(wěn)定方式進行表達，借此研究目的基因的結(jié)構與功能，或獲得該基因的表達產(chǎn)物。這一過程就是基因工程。

廣義：轉(zhuǎn)基因動物；克?。换虼虬?；基因組計劃等均屬于基因工程的范疇。目的基因獲得表達載體構建基因的導入整合與表達的鑒定二、基因工程的基本步驟表達產(chǎn)物的提取、純化與鑒定真核細胞總RNA的電泳結(jié)果：核酸電泳技術

1.瓊脂糖凝膠電泳2.SDS500200010007501002001DL2000marker2BamHI和EcoRI雙切3BamHI單切4HindⅢ單切5重組質(zhì)粒pVAX1/ABPS112345二、一些重要技術原理介紹

重點介紹DNA雙脫氧測序技術，核酸探針技術，PCR技術等。（一）DNA雙脫氧測序

1.Dotblot2.Southernblot：DNA3.

Northernblot:RNA（三）PCR技術

1.基本原理

2.引物設計1)長度;2)GC%;3)stem-loop;4)dimer;5)錯配;6)5’末端可以不配對3.應用:科學研究；醫(yī)學與獸醫(yī)臨床。KaryB.MullisLaJolla,CA,USA.B.1944DNA生物合成與PCR方法合成DNA的異同點:1.相同點：均為酶促反應；均需要模板和引物；底物為dNTP；半保留復制；均為5’3’方向復制。2.不同點：1）反應條件不同：體內(nèi)為生理條件，體外為94℃、52℃及72℃等變溫條件；2）參與反應的物質(zhì)種類和數(shù)量不同；3）引物不同，體內(nèi)為RNA，體外為DNA，且在DNA合成后，前者被切除掉，后者作為終產(chǎn)物的一部分；4）體內(nèi)為半不連續(xù)合成，體外為連續(xù)合成；5）體內(nèi)單復制原點或多復制原點，單方向或雙方向復制；6）體內(nèi)受細胞周期的調(diào)控，體外按人們的意愿進行；7）體內(nèi)具有校正、修復的功能（錯配率較低），體外無（錯配率較高）；8）體內(nèi)DNA的復制為全部染色體DNA的復制，體外僅復制兩引物之間的DNA序列。（四）目的基因的改造技術1.引物介導的基因定點突變技術2.盒式突變(cassettemutagenesis)

3.GenesShuffling四、獲得目的基因的方法

基因文庫（基因組文庫和cDNA文庫），化學合成，PCR等方法。還有DD-PCR以及基因芯片等技術。（一）基因組文庫目的：種質(zhì)資源的保護；基因組測序；基因組基因或調(diào)控序列的克隆等。

家蠅卵黃蛋白基因組基因的克隆和序列分析

結(jié)果1:GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTTAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC卵黃蛋白基因部分DNA片段特異性探針序列特異性探針制備

制備了大小為768bp的地高辛標記的DNA片段特異性探針，工作濃度為1:2000。結(jié)果2:

陽性克隆的篩選和純化1#positiveclone（about2000plaques/plate）Fig.3Screeningresultof1stroundinsituhybridization圖3第一次噬菌斑原位雜交篩選結(jié)果YP1

2#positiveclone（about200plaques/plate）Fig.4Screeningresultof2ndroundinsituhybridization圖4第二次噬菌斑原位雜交篩選結(jié)果Numbers：11positiveclone（11plaques/plate）Fig.5Screeningresultof3rdroundinsituhybridization圖5第3次噬菌斑原位雜交篩選結(jié)果獲得了含家蠅卵黃蛋白基因的陽性克隆2101AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG22002201CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC23002301ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG24002401AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC25002501TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC26002601TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG27002701CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA28002801TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA29002901ACTCCCGCCCGCAAACAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA30003001AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT31003101TAAAAAAAAAAAAAAAAATAAGACTCTGAACATTACAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA32003201AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCTAAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT33003301TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG34003401AAAGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA35003501GTAGATTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT36003601TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATAAAAAAATTCACAATT37003701TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC38003801CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC39003901TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACTTTCCTTCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG3991圖3.卵黃蛋白基因組基因全序列（二）cDNA文庫的構建家蠅早期胚胎轉(zhuǎn)基因前后的

差異表達研究（三）DD-PCR技術5’N’M’AAAAAAAAAAAAAn細胞總RNA或poly(A)RNA

5’N’M’AAAAAAAAAAAAAncDNA3’NMTTTTTTTTTTTT簡并錨定引物

進行PCR

隨機十聚體NNNNNNNNNN——————————————————————NMTTTTTTTTTTTT持續(xù)循環(huán)

NNNNNNNNNN————————————

——————————NMTTTTTTTTTTTT

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品A樣品B作Northern探針作cDNA文庫篩選探針作亞克隆和測序樣品反轉(zhuǎn)錄反應切取目的帶,重新擴增,回收純化

五、重組質(zhì)粒（表達載體）的構建與鑒定1.DNA（載體和目的片段）的酶切與回收。2.目的片段與載體的連接。二者的摩爾比應滿足以下比例：粘端：3~5:1；鈍端：6~8:13.轉(zhuǎn)化與重組質(zhì)粒的篩選、鑒定。1）初步鑒定：抗性；α-互補；快速鑒定；原位雜交；PCR。2）酶切鑒定：大小和方向。3）測序鑒定：雙脫氧測序法。六、基因?qū)爰夹g（一）細菌

1.氯化鈣；2.電穿孔技術。（二）細胞1.脂質(zhì)體；2.磷酸鈣；3.電穿孔；4.顯微注射；5.VirusVector。（三）受精卵1.顯微注射；2.電穿孔技術；3.精子載體；4.ESC；5.VirusVector（

RT-VorLentivirus-V）。七、常用表達系統(tǒng)（一）原核表達系統(tǒng)：包涵體；分泌型。

已成功的基因工程產(chǎn)品絕大部分是利用原核系統(tǒng)生產(chǎn)的，如IFN、IL、TNF、G-CSF、GM-CSF等。（二）真核表達系統(tǒng)：傳代細胞；酵母；生物反應器等。1.傳代細胞：如CHO、BHK、Vero、MDCK等；2.酵母：畢赤（甲醇）酵母。3.生物反應器：如乳腺、血液、尿液、雞蛋、昆蟲等。世界上第一個動物（山羊）乳腺生物反應器產(chǎn)品—重組人抗凝血酶Ⅲ（商品名ATryn

）于2006年獲準上市。由全球最著名的動物乳腺生物反應器研發(fā)企業(yè)——美國Genzyme轉(zhuǎn)基因公司研制成功。重組蛋白動物生產(chǎn)公司LA,α-LA,單抗,溶菌酶,牛AdvancedCellTechnology,GeneticGH,INS,HSA牛SavingsandClone,Infigen,PharmingATⅢ,tPA,單抗,GH,α1-抗胰蛋白酶山羊GenzymeTransgenics,NexiaBiotechnologies,PPLtherapeutics纖維蛋白原表面蛋白B,原膠原重組抗體小鼠Abgenix,Medarex凝血因子Ⅷ，蛋白C,血紅蛋白豬Alexion,Biotransplant,PPLTherapeuticsCT,IGF-1,IL-2,EPO,GH,細胞外SOD,兔Pharming,PPLTherapeuticsa2-葡糖苷酶,糖原樣肽兔Pharming,PPLTherapeuticsα1-抗胰蛋白酶,凝血因子Ⅷ,Ⅸ,綿羊

PPLTherapeuticsIGF-1,纖維蛋白原綿羊PPLTherapeuticsNATUREBiotechnology,October,2000表1.部分已表達的蛋白質(zhì)蛋白/肽公司開發(fā)現(xiàn)狀治療疾病國外公司已開發(fā)的部分轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品DevelopmentstatusofaselectedlistofproteinsproducedbytransgenicanimalsABX-IL8mAbAbgenix臨床I/II牛皮癬ABX-EGFmAbAbgenixPreclinicalEGF-依賴性癌癥a-1-抗胰蛋白酶PPLTherapeuticsPhaseII膽囊纖維化a-1蛋白酶抑制劑GenzymeTransgenicsR&D遺傳缺陷β-IFNGenzymeTransgenicsR&D多發(fā)性硬化膠原IIPharmingPreclinical風濕性關節(jié)炎因子VIIPPLTherapeuticsPreclinical出血時因子XIPPLTherapeuticsPreclinicalB型血友病纖維蛋白原PPLTherapeuticsPreclinical外傷和手術時作組織膠粘劑胰高血素樣肽-1PPLTherapeuticsR&DII-型糖尿病人GHGenzymeTransgenicsR&D身體生長發(fā)育，脂肪動員HASGenzymeTransgenicsR&D血漿膨脹劑和藥物賦形劑MSP-1(瘧疾苗)GenzymeTransgenicsR&D瘧疾蛋白CPPLTherapeuticsPreclinical防止深部靜脈的血栓形成降鈣素(salmon)PLLTherapeuticsPreclinical骨質(zhì)疏松tPAGenzymeTransgenicsR&D心肌梗塞和非栓塞（三）提高真核表達效率的技術方法1.選用強啟動子，如CMV、EF1α等；2.組成型表達（可誘導表達）；3.增強子，如MAR序列；4.poly(A)；5.Dhfr加壓篩選系統(tǒng)；6.串聯(lián)表達；7.穩(wěn)定表達（瞬時表達）；8.Kozak序列?；蚪M序列的選擇性擴增—染色體擴增以dhfr基因的擴增為例，說明基因組序列的選擇性擴增機制。二氫喋啶FH2FH4CoF衍生物合成嘌呤或嘧啶注：

（1）合成酶；（2）還原酶。（1）（2）

染色體擴增的本質(zhì)是細胞內(nèi)特定基因拷貝數(shù)的專一性大量擴增(amplification)。（Amplificationreferstotheproductionofadditionalcopiesofachromosomalsequence,foundasintrachromosomalorextrachromosomalDNA.）葉酸四氫葉酸MammaliangenesforDHFR(dihydrofolatereductase)havethesamerelativeorganizationofrathershortexonsandverylongintrons,butvaryextensivelyinthelengthsofcorrespondingintrons.1.類型：

Unstablelines

andStablelines

Inunstablelines,theamplifiedgenesareatleastpartiallylostwhentheselectivepressureisreleased,becausetheamplifiedgenesexistasanextra-chromosomalarray.Instablelines,theamplifiedgenesareretained,becausetheyresideonthechromosome,atthesiteusuallyoccupiedbythesingledhfrgene.Usuallytheotherchromosomeretainsitsnormalsinglecopyofdhfr.