核酸分子雜交上周琳

核酸分子雜交上周琳第1頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五主講內(nèi)容核酸分子雜交的基本原理核酸探針核酸分子雜交技術(shù)第2頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五一、DNA的變性（denaturation）變性：在一定的條件下，DNA雙螺旋之間的氫鍵斷裂，解離成兩條無規(guī)則的卷曲狀單鏈DNA分子，此現(xiàn)象稱為變性。第3頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五復(fù)性：去除變性因素后，單鏈DNA通過堿基互補(bǔ)配對原則重新結(jié)合成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。二、DNA的復(fù)性(renaturation)退火淬火第4頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五

根據(jù)核酸變性和復(fù)性的原理，來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補(bǔ)配對形成異源雙鏈雜交體的過程。三、核酸分子雜交雜交的基礎(chǔ)：核酸分子單鏈之間的堿基互補(bǔ)配對。注：分子雜交可以在DNA與DNA、RNA與RNA、RNA與DNA的兩條單鏈之間進(jìn)行。第5頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五

核酸分子的濃度溫度離子強(qiáng)度核酸分子的復(fù)雜性

影響核酸分子雜交的因素第6頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五四、核酸分子雜交技術(shù)

通過標(biāo)記的單鏈核酸探針與固相支持物上或液相中單鏈的互補(bǔ)靶序列退火形成雙鏈雜交體，而定性或定量檢測特異DNA或RNA的技術(shù)。第7頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五

第二節(jié)核酸探針

核酸探針的概念

核酸探針的類型核酸探針的標(biāo)記

核酸探針的檢測方法

第8頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五

核酸探針(nucleicprobe)：指能夠與待測的靶核酸片段互補(bǔ)結(jié)合的帶有特殊可檢測標(biāo)記的核苷酸片段。一、概念第9頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五按化學(xué)本質(zhì)分：DNA探針

RNA探針按標(biāo)記物分：放射性標(biāo)記探針非放射性標(biāo)記探針按分子大小分：寡核苷酸探針單鏈探針雙鏈探針二、核酸探針的類型第10頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五二、常見核酸探針1.基因組DNA探針

2.cDNA探針

3.RNA探針4.寡核苷酸探針來源于某種生物的基因組，為某一基因的全部或部分序列。來源于cDNA,不含有內(nèi)含子序列，適用于基因表達(dá)研究。大多以單鏈形式存在,雜交效率高。可通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得。用化學(xué)合成技術(shù)在體外合成的單鏈DNA,長度一般為20-50bp。第11頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五三、核酸探針的標(biāo)記

1.核酸探針的標(biāo)記物（1）放射性核素標(biāo)記物常用放射性核素標(biāo)記物有：32P、35S、3H優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度極高,可檢測到10-14～10-18g的物質(zhì)，在最適條件下，可以測出樣品中少于1000個分子的核酸含量，光譜分析法只能鑒定10-9g的物質(zhì)。②對堿基配對的特異性和穩(wěn)定性無影響。③特異性高。缺點(diǎn)：放射性污染，有半衰期。第12頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五32P或35S同位素標(biāo)記的單核苷酸（α）（γ）（OH）HOH第13頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五(2)非放射性標(biāo)記物優(yōu)點(diǎn)：無放射性污染，穩(wěn)定性好，可以較長時間存放，處理方便。缺點(diǎn)：靈敏度、特異性不夠理想。常用非放射性標(biāo)記物有：生物素、地高辛、酶、熒光素第14頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五2.核酸探針的標(biāo)記方法（一）酶促法缺口平移法隨機(jī)引物法DNA探針末端標(biāo)記法（二）化學(xué)法預(yù)先標(biāo)記酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)移探針第15頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五（1）缺口平移法（nicktranslation）

由DNA酶Ⅰ和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。酶促法第16頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五隨機(jī)引物：含有各種可能排列順序的六核苷酸片段的混合物。（2）隨機(jī)引物法（randompriming）酶促法第17頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五

在5’或3’端通過酶促反應(yīng)加上標(biāo)記物DNA聚合酶ⅠKlenow片段3’末端標(biāo)記法T4多核苷酸激酶5’末端標(biāo)記法聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)記DNA探針RNA探針的標(biāo)記寡核苷酸鏈探針的標(biāo)記（3）探針的末端標(biāo)記酶促法第18頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五Ⅰ

DNA聚合酶ⅠKlenow片段3’末端標(biāo)記法限制性內(nèi)切酶酶促法第19頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五ⅡT4多核苷酸激酶5’末端標(biāo)記法ATPADPγ32PT4多核苷酸激酶堿性磷酸酶酶促法第20頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五1.生物素地高辛標(biāo)記核酸探針2.酶、熒光素標(biāo)記核酸探針化學(xué)法第21頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五生物素化核苷酸①生物素(biotin)標(biāo)記生物素-16-dUTP第22頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五

光敏生物素標(biāo)記法強(qiáng)光10-20分鐘

光敏生物素的結(jié)構(gòu)第23頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五②

地高辛(digoxigenin)標(biāo)記Dig-11-dUTP的結(jié)構(gòu)第24頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五③

酶標(biāo)記堿性磷酸酶辣根過氧化物酶④熒光素標(biāo)記異硫氰酸熒光素（FITC）熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架結(jié)合第25頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五四、核酸探針的檢測

核酸分子雜交反應(yīng)完成后，必須使已標(biāo)記的核酸探針顯示出可檢測信號，方能檢測未知的待測核酸序列。

1.放射性同位素標(biāo)記探針的檢測

2.非放射性標(biāo)記探針的檢測第26頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五1.放射性同位素標(biāo)記探針的檢測（1）放射自顯影：利用放射線在X線底片的成影作用來檢測雜交信號。（2）液體閃爍計數(shù)器：第27頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五2.非放射性標(biāo)記探針的檢測（1）直接檢測：雜交反應(yīng)后可以立刻觀測結(jié)果。如酶和熒光素直接標(biāo)記的探針。（2）間接檢測：反應(yīng)結(jié)果不能被直接檢測,需經(jīng)兩步反應(yīng)：①與可檢測系統(tǒng)偶聯(lián)的偶聯(lián)反應(yīng)，②顯色反應(yīng)。第28頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五

（1）直接檢測法

①堿性磷酸酶顯色體系②辣根過氧化物酶顯色體系酶促顯色法熒光法第29頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五Dig-DNA探針+抗Dig抗體-堿性磷酸酶（或辣根過氧化物酶）+底物

（2）間接檢測法

①偶聯(lián)反應(yīng)第30頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五②顯色反應(yīng)酶法：通過酶促反應(yīng)使其底物形成有顏色的反應(yīng)產(chǎn)物堿性磷酸酶辣根過氧化物酶DAB（二氨基聯(lián)苯胺）→紅棕色TMB（四甲基聯(lián)苯胺）→藍(lán)色第31頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

印跡雜交核酸原位雜交液相印跡雜交固相雜交第32頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五

是將電泳分離的待測DNA片段固定在固相載體上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的位置上顯示雜交信號的方法。一、傳統(tǒng)的核酸分子雜交技術(shù)1、Southern印跡雜交第33頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五提取DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤與DNA探針雜交放射自顯影基本步驟預(yù)雜交第34頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五圖虹吸印跡法第35頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五

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