定量PCR基本原理及方法課件

定量PCR基本原理及方法熒光定量PCR基本原理熒光定量PCR標記方法熒光定量PCR不同方法學的應用內容

定量PCR技術的產生1992年由Higuchi等人第一次報告：使用EB加入PCR反應體系，經改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測樣品的熒光強度核酸

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染料熒光后來用與雙鏈DNA有更強結合力的SYBRGreenI取代EB熒光定量PCR基本原理閾值：PCR擴增信號進入相對穩(wěn)定的對數(shù)增長期時的熒光值。閾值（threshold）的設定PCRefficiency=[10(-1/slope)]-1Whereslope=1/mSlope-3.322100%efficiencyPCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。Ct值——n：擴增循環(huán)數(shù)

n:擴增循環(huán)數(shù)的確定logN=logN0+nlogEn=Ct每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品作出標準曲線，根據(jù)未知樣品的Ct值，即可計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

Ct值與起始模板的關系Y軸—Ct值X—起始拷貝數(shù)的對數(shù)標準曲線由系列稀釋的已知濃度的樣品做標準曲線計算待測樣品的初始模板濃度log

N0=-CtlogE+logN絕對定量——未知濃度的樣品與標準曲線相比較5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission內摻式染料SYBR-GreenI

5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission內摻式染料

SYBR-GreenI

RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標記探針（TaqmanProbe）Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（FRETProbe）熒光定量PCR不同方法學的應用研究目的標記方法定量分析（基因拷貝數(shù)的絕對定量，基因表達調控的相對定量）

Sybr-Green(LCGreen),Taqman,MolecularBeacon,etc

研究目的基因型分析（SNP、突變型分析）

Taqman,MolecularBeacon,FRET,LCGreen熔解曲線分析

Sybr-Green,LCGreen,MolecularBeacon,FRET某科研用戶使用Rotor-Gene3000進行基因表達相對定量分析，下圖為用??Ct法得出的分析結果。（自備標準品，檢測樣品做3次重復復管）HouseKeeperGeneGeneofInterest相對定量利用溶解曲線進行實驗條件的優(yōu)化（RG3000）熔解曲線分析Annealingat60℃Annealingat63℃標記方法

Taqman

定量分析，基因型分析

Sybr-Green

定量分析，熔解曲線分析，基因型分析(LCGreen)

MolecularBeacon

定量分析，熔解曲線分析，基因型分析

FRET

定量分析，熔解曲線分析，基因型分析

AmpliflourProbe，LUX

定量分析雙Taqman探針法檢測野生型和突變型在基因型分析中，可采用兩種不同的Taqman探針（分別針對野生型和突變型)，即一個突變型探針以一種熒光素（Flr）標記，而野生型探針則用不同的熒光物（Tet）標記。如果只有一種信號被擴增出來，則樣本為對應的基因型（野生型或突變型）的純合子；如二者都被有效地擴增出來，則樣本為雜合型。利用擴增信號的種類來分型雜合型野生型突變型

FRET探針進行熔解曲線分析確定基因型

FRET探針與模板結合時，因共振能量的傳遞而信號增強，而當在Tm值時，F(xiàn)RET探針與PCR產物分開，熒光信號減弱。通過實時捕捉到的PCR產物在熔解過程中熒光信號的變化，得到PCR產物的熔解曲線。因為發(fā)生基因突變的PCR產物有特定的Tm值，通過測定探針與PCR產物分開時的熔解溫度Tm值，就能確定樣品的基因型。利用熔解曲線檢測基因突變雜合型野生型突變型利用內摻式染料進行高分辨率熔解曲線（HRM）分析基因型HRM根據(jù)序列長度、GC含量和互補性分析樣品，可精確到單堿基差異。相比其它方法節(jié)約了探針和標記的費用。上圖：用