重組限制性內切酶與片段化詳解演示文稿

重組限制性內切酶與片段化詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有46頁\編輯于星期二優(yōu)選重組限制性內切酶與片段化現(xiàn)在是2頁\一共有46頁\編輯于星期二天然DNA的提?。ㄗ詫W）分子克隆實驗指南(第三版)精編分子生物學實驗指南現(xiàn)在是3頁\一共有46頁\編輯于星期二2.限制性內切酶和DNA片段化核酸內切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與應用，才真正使DNA分子的體外切割和連接成為可能。這兩種酶是基因工程賴以創(chuàng)立的重要的酶學基礎?，F(xiàn)在是4頁\一共有46頁\編輯于星期二限制性內切酶一類能識別dsDNA分子內部的特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸酶來源：主要從原核生物中分離純化而來II型核酸內切酶：2300種以上，可識別230種不同的DNA序列（1994年，美國，分子生物學百科全書）目前發(fā)現(xiàn)有限制性內切酶的生物主要是細菌，少數(shù)霉菌和藍藻?，F(xiàn)在是5頁\一共有46頁\編輯于星期二這種大自然賦予基因工程學家的了不起的禮物是如何發(fā)現(xiàn)的呢現(xiàn)在是6頁\一共有46頁\編輯于星期二2.1寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象大多數(shù)的細菌對于噬菌體的感染都存在這一些功能性障礙。如：目前尚未發(fā)現(xiàn)有任何一種既可感染假單胞菌又可感染大腸桿菌的噬菌體，且非寄主細菌的RNA聚合酶不能夠識別“外源”噬菌體的啟動子，即使噬菌體的吸附和轉錄能進行，也仍然存在這另一種功能障礙——即為寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象這種現(xiàn)象類似于人體的免疫系統(tǒng)，它可辨別自身的DNA和外來的DNA，并使后者降解——吳乃虎，基因工程（第二版，上冊），P122現(xiàn)在是7頁\一共有46頁\編輯于星期二限制——修飾現(xiàn)象Kλ（B）λ（K）λ（B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長的λ噬菌體第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生長受寄主限制Kλ（K）存活下來的噬菌體再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制（K菌株已經(jīng)對其進行了修飾）現(xiàn)在是8頁\一共有46頁\編輯于星期二現(xiàn)在是9頁\一共有46頁\編輯于星期二產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因何在甲基化酶：能使細胞自身核酸的內切酶識別序列的堿基甲基化，從而使自身核酸免受內切酶水解——細菌的“防御”系統(tǒng)核酸內切酶：識別并水解外源DNA（外來核酸在內切酶識別序列上沒有甲基化修飾作保護）研究發(fā)現(xiàn)：原來是由兩種酶配合完成，一種是起修飾作用的甲基化酶，另一種是核酸內切酶（1962年）限制修飾現(xiàn)在是10頁\一共有46頁\編輯于星期二限制——修飾體系Kλ（B）λ（K）λ（B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長的λ噬菌體Kλ（K）再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制（K菌株已經(jīng)對其進行了修飾）λ（B）噬菌體感染大腸桿菌K菌株后，其DNA大部分被內切酶降解了，但有極少部分能在特定序列甲基化，避免被酶解，因此有少量噬菌斑形成。現(xiàn)在是11頁\一共有46頁\編輯于星期二在限制修飾系統(tǒng)中限制作用是指一定類型的細菌可以通過限制性酶的作用，破壞入侵的外源DNA(如噬菌體DNA等)，使得外源DNA對生物細胞的入侵受到限制；

而生物細胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通過修飾酶的作用：在堿基中特定的位置上發(fā)生了甲基化而得到了修飾，可免遭自身限制性酶的破壞，這就是限制修飾系統(tǒng)中修飾作用的含義?，F(xiàn)在是12頁\一共有46頁\編輯于星期二2.2分類核酸外切酶（exonuclease）

核酸內切酶(endonuclease)

核酸酶從核酸鏈的一端開始，一個接一個地消化降解核苷酸從核酸鏈分子內部切割3’，5’磷酸二酯鍵，使之斷裂形成小片段核酸內切酶(endonuclease)：按限制性酶的組成、限制和修飾活性、切斷核酸的情況不同，分三類(I，II，III)，通常指的是II型。（教材P34）希臘文exo為外部之意，endo為內部之意?，F(xiàn)在是13頁\一共有46頁\編輯于星期二限制性核酸內切酶的類型24-26bp處特異性切割隨機性切割

距識別序列下游識別序列內或附近距識別序列1kb處切割位點無規(guī)律旋轉對稱序列無規(guī)律識別序列ATPMg2+SAMMg2+

ATPMg2+SAM輔助因子異源二聚體同源二聚體異源三聚體蛋白結構雙功能單功能多功能限制修飾III型II型I型主要特性現(xiàn)在是14頁\一共有46頁\編輯于星期二2.3命名HindIII同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶如從流感嗜血桿菌d菌株（Haemophilusinfluenzaed）先后發(fā)現(xiàn)3種限制性酶，則分別命名為HindI，HindII，HindIII大腸桿菌R菌株REscherichia嗜血流感桿菌d株dinfflluenzaeHaemophiillus株名（型號）種名屬名coli現(xiàn)在是15頁\一共有46頁\編輯于星期二2.4基本特性識別并切割雙鏈DNA（環(huán)狀或線狀）分子中4－8bp的特定序列（回文序列）切割產(chǎn)生的單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布通常并不彼此直接相對（粘性）斷裂形成的DNA片段，往往具有互補的單鏈延伸末端現(xiàn)在是16頁\一共有46頁\編輯于星期二2.5內切酶識別序列的特征長度：4－8bp結構特征：雙重旋轉對稱的回文結構切割后產(chǎn)生的末端：粘性末端3-OH，5－P或平末端EcoRI的識別序列5’…GCT

GAATTC

GAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的切割位點現(xiàn)在是17頁\一共有46頁\編輯于星期二序列長度：多數(shù)為6bp4：Sau3AIGATC5：EcoRIICCWGGW=AorTNciICCSGGS=CorG6：EcoRIGAATTC

HindIIIAAGCTT

BamHIGGATCC現(xiàn)在是18頁\一共有46頁\編輯于星期二>6

NotIGCGGCCGC8

BbvCICCTCAGC7

PpuMIRGGWCCY7R=AorGY=CorT現(xiàn)在是19頁\一共有46頁\編輯于星期二結構多為雙重旋轉對稱的回文結構，產(chǎn)生的末端為平末端或粘性末端。如：ABCC’B’A’A’B’C’CBA大寫字母代表核苷酸，帶撇的大寫字母代表互補的核苷酸，垂直線代表對稱軸或ABN’B’A’A’B’NBA或ABB’A’A’B’BA回文序列：指在雙鏈DNA序列中按確定的方向閱讀，雙鏈中的每一條鏈的序列都是相同的?，F(xiàn)在是20頁\一共有46頁\編輯于星期二二重旋轉對稱EcoRIGAATTCCTTAAGHindIIIAAGCTTTTCGAA現(xiàn)在是21頁\一共有46頁\編輯于星期二粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環(huán)化起來。平末端的DNA片段則不易于重新環(huán)化?，F(xiàn)在是22頁\一共有46頁\編輯于星期二5’…G-C-T-G-OHP--A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’EcoRI的切割位點1：5’粘性末端：突出的單鏈末端為5’端（5’P）2：3’粘性末端：突出的單鏈末端為3’端（3’OH）5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G

…3’3’…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI的切割位點現(xiàn)在是23頁\一共有46頁\編輯于星期二5’…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’PvuII的切割位點3：平末端：無突出的單鏈現(xiàn)在是24頁\一共有46頁\編輯于星期二非對稱AccBSICCGCTCGGCGAG現(xiàn)在是25頁\一共有46頁\編輯于星期二識別序列出現(xiàn)頻率1/4n4Nt=44=2566Nt=46=4096現(xiàn)在是26頁\一共有46頁\編輯于星期二稀切酶（rarecuttingenzymes）在DNA分子中出現(xiàn)的幾率低，故稱之為稀切酶識別序列：比較長；富含AT；富含GC現(xiàn)在是27頁\一共有46頁\編輯于星期二同裂酶(isoschizomer)酶來源不同，但具有相同的識別序列（切割位點可相同，也可不同）切割位點不同，是不同的酶切割位點相同，是相同的酶，來自不同生物現(xiàn)在是28頁\一共有46頁\編輯于星期二同尾酶（isocaudamer）來源各異，識別的靶序列也不相同，但切割后的DNA片段具有相同的黏性末端，這樣的一組限制性內切酶稱為同尾酶?，F(xiàn)在是29頁\一共有46頁\編輯于星期二2.6切割位點DNA在限制性內切酶的作用下，使多聚核苷酸上磷酸二酯鍵斷開的位置EcoRIICCWGG

10(N)CGA(N)6TGC(N)12部分在兩翼少數(shù)兩側/端多數(shù)在內部現(xiàn)在是30頁\一共有46頁\編輯于星期二偏愛位點P42切割位點兩側序列的核苷酸組成亦與切割效率有關，即某些限制酶對同一介質中的有些位點表現(xiàn)出偏愛性切割現(xiàn)在是31頁\一共有46頁\編輯于星期二2.7反應系統(tǒng)底物：純，線性，有保護序列酶：樣品，識別序列的密度，容積活性反應緩沖液反應條件現(xiàn)在是32頁\一共有46頁\編輯于星期二大部分II型核酸內切酶需要相似的反應條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mMVolume20--100μl反應溫度、時間37℃，1--1.5hr0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶現(xiàn)在是33頁\一共有46頁\編輯于星期二1）DNA純度：要求較純因素：蛋白質、乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿以及某些高濃度金屬離子措施：增加酶的用量；擴大反應系統(tǒng)體積延長反應時間；添加亞精胺2.7.1底物現(xiàn)在是34頁\一共有46頁\編輯于星期二2)DNA的甲基化程度核酸內切限制酶是原核生物限制—修飾體系的組成部分，因此識別序列中特定核苷酸的甲基化作用，便會強烈地影響酶的活性。為避免產(chǎn)生這樣的問題，在基因克隆中，質粒DNA是來源于甲基化酶缺陷型的大腸桿菌菌株。這樣制備的質粒DNA，其中的內切酶識別序列沒有甲基化，不受限制。現(xiàn)在是35頁\一共有46頁\編輯于星期二3）DNA分子構型

效率：線性DNA分子

大于超螺旋質粒DNA環(huán)狀病毒DNA現(xiàn)在是36頁\一共有46頁\編輯于星期二4）識別序列的側面序列

限制酶切割DNA，對識別序列兩側的非識別序列有長度要求，只含識別序列的寡核苷酸是不會被酶切的，故通常要在識別序列兩側多加若干個核苷酸現(xiàn)在是37頁\一共有46頁\編輯于星期二試劑公司提供的包裝說明書會標明酶活性單位數(shù)和容積活性，最佳作用條件2.7.2內切酶決定酶的用量酶本身的催化活性底物DNA的樣品1.用量現(xiàn)在是38頁\一共有46頁\編輯于星期二2酶活單位1個酶活單位：在最適反應條件下，在20l反應液中反應1小時，使1gDNA（標準DNA）完全消化所需的酶活性稱為1個單位。（教材P43）1U核酸內切酶的酶活性：在最佳反應條件下反應1小時，完全水解1μg標準DNA（λDNA

）所需的酶量容積活性：1μL酶液中具有的酶活性單位，即U/μL。Q：某公司產(chǎn)品——內切酶a標注為200U/μL，現(xiàn)有提取到50ug的λDNA，問：在最佳反應條件下反應1小時，需要多少體積的內切酶a？現(xiàn)在是39頁\一共有46頁\編輯于星期二常規(guī)緩沖液pH，Mg++，DTT/β-ME，(10X)pH7.0-7.9(at25℃)Tris-HCl，乙酸離子強度：NaCl高中低100mM50mM0③Mg++10mMMgCl2，MgAc2.7.3反應緩沖液對絕大多數(shù)限制酶來說，在pH=7．4的條件下，其功能最佳。現(xiàn)在是40頁\一共有46頁\編輯于星期二大多數(shù)核酸內切限制酶的標準反應溫度都是37℃一部分為50-65℃少數(shù)25-30℃高溫作用酶于37℃時活性多數(shù)10-50%

TaqI(65℃)10%，ApoI(50℃)50%銷售商在產(chǎn)品說明中會標明最佳反應溫度2.7.4反應溫度現(xiàn)