重組限制性內(nèi)切酶與片段化詳解演示文稿

重組限制性內(nèi)切酶與片段化詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二優(yōu)選重組限制性內(nèi)切酶與片段化現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二天然DNA的提?。ㄗ詫W(xué)）分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二2.限制性內(nèi)切酶和DNA片段化核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，才真正使DNA分子的體外切割和連接成為可能。這兩種酶是基因工程賴以創(chuàng)立的重要的酶學(xué)基礎(chǔ)?，F(xiàn)在是4頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二限制性內(nèi)切酶一類能識(shí)別dsDNA分子內(nèi)部的特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸酶來(lái)源：主要從原核生物中分離純化而來(lái)II型核酸內(nèi)切酶：2300種以上，可識(shí)別230種不同的DNA序列（1994年，美國(guó)，分子生物學(xué)百科全書(shū)）目前發(fā)現(xiàn)有限制性內(nèi)切酶的生物主要是細(xì)菌，少數(shù)霉菌和藍(lán)藻?，F(xiàn)在是5頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二這種大自然賦予基因工程學(xué)家的了不起的禮物是如何發(fā)現(xiàn)的呢現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二2.1寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象大多數(shù)的細(xì)菌對(duì)于噬菌體的感染都存在這一些功能性障礙。如：目前尚未發(fā)現(xiàn)有任何一種既可感染假單胞菌又可感染大腸桿菌的噬菌體，且非寄主細(xì)菌的RNA聚合酶不能夠識(shí)別“外源”噬菌體的啟動(dòng)子，即使噬菌體的吸附和轉(zhuǎn)錄能進(jìn)行，也仍然存在這另一種功能障礙——即為寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象這種現(xiàn)象類似于人體的免疫系統(tǒng)，它可辨別自身的DNA和外來(lái)的DNA，并使后者降解——吳乃虎，基因工程（第二版，上冊(cè)），P122現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二限制——修飾現(xiàn)象Kλ（B）λ（K）λ（B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長(zhǎng)的λ噬菌體第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生長(zhǎng)受寄主限制Kλ（K）存活下來(lái)的噬菌體再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制（K菌株已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行了修飾）現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因何在甲基化酶：能使細(xì)胞自身核酸的內(nèi)切酶識(shí)別序列的堿基甲基化，從而使自身核酸免受內(nèi)切酶水解——細(xì)菌的“防御”系統(tǒng)核酸內(nèi)切酶：識(shí)別并水解外源DNA（外來(lái)核酸在內(nèi)切酶識(shí)別序列上沒(méi)有甲基化修飾作保護(hù)）研究發(fā)現(xiàn)：原來(lái)是由兩種酶配合完成，一種是起修飾作用的甲基化酶，另一種是核酸內(nèi)切酶（1962年）限制修飾現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二限制——修飾體系Kλ（B）λ（K）λ（B）：能夠在大腸桿菌B菌株上生長(zhǎng)的λ噬菌體Kλ（K）再次感染K菌株，則形成的噬菌斑很多，不受限制（K菌株已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行了修飾）λ（B）噬菌體感染大腸桿菌K菌株后，其DNA大部分被內(nèi)切酶降解了，但有極少部分能在特定序列甲基化，避免被酶解，因此有少量噬菌斑形成?，F(xiàn)在是11頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二在限制修飾系統(tǒng)中限制作用是指一定類型的細(xì)菌可以通過(guò)限制性酶的作用，破壞入侵的外源DNA(如噬菌體DNA等)，使得外源DNA對(duì)生物細(xì)胞的入侵受到限制；

而生物細(xì)胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通過(guò)修飾酶的作用：在堿基中特定的位置上發(fā)生了甲基化而得到了修飾，可免遭自身限制性酶的破壞，這就是限制修飾系統(tǒng)中修飾作用的含義?，F(xiàn)在是12頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二2.2分類核酸外切酶（exonuclease）

核酸內(nèi)切酶(endonuclease)

核酸酶從核酸鏈的一端開(kāi)始，一個(gè)接一個(gè)地消化降解核苷酸從核酸鏈分子內(nèi)部切割3’，5’磷酸二酯鍵，使之?dāng)嗔研纬尚∑魏怂醿?nèi)切酶(endonuclease)：按限制性酶的組成、限制和修飾活性、切斷核酸的情況不同，分三類(I，II，III)，通常指的是II型。（教材P34）希臘文exo為外部之意，endo為內(nèi)部之意?，F(xiàn)在是13頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二限制性核酸內(nèi)切酶的類型24-26bp處特異性切割隨機(jī)性切割

距識(shí)別序列下游識(shí)別序列內(nèi)或附近距識(shí)別序列1kb處切割位點(diǎn)無(wú)規(guī)律旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列無(wú)規(guī)律識(shí)別序列ATPMg2+SAMMg2+

ATPMg2+SAM輔助因子異源二聚體同源二聚體異源三聚體蛋白結(jié)構(gòu)雙功能單功能多功能限制修飾III型II型I型主要特性現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二2.3命名HindIII同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶如從流感嗜血桿菌d菌株（Haemophilusinfluenzaed）先后發(fā)現(xiàn)3種限制性酶，則分別命名為HindI，HindII，HindIII大腸桿菌R菌株REscherichia嗜血流感桿菌d株dinfflluenzaeHaemophiillus株名（型號(hào)）種名屬名coli現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二2.4基本特性識(shí)別并切割雙鏈DNA（環(huán)狀或線狀）分子中4－8bp的特定序列（回文序列）切割產(chǎn)生的單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布通常并不彼此直接相對(duì)（粘性）斷裂形成的DNA片段，往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二2.5內(nèi)切酶識(shí)別序列的特征長(zhǎng)度：4－8bp結(jié)構(gòu)特征：雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的回文結(jié)構(gòu)切割后產(chǎn)生的末端：粘性末端3-OH，5－P或平末端EcoRI的識(shí)別序列5’…GCT

GAATTC

GAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的切割位點(diǎn)現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二序列長(zhǎng)度：多數(shù)為6bp4：Sau3AIGATC5：EcoRIICCWGGW=AorTNciICCSGGS=CorG6：EcoRIGAATTC

HindIIIAAGCTT

BamHIGGATCC現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二>6

NotIGCGGCCGC8

BbvCICCTCAGC7

PpuMIRGGWCCY7R=AorGY=CorT現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二結(jié)構(gòu)多為雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的回文結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生的末端為平末端或粘性末端。如：ABCC’B’A’A’B’C’CBA大寫(xiě)字母代表核苷酸，帶撇的大寫(xiě)字母代表互補(bǔ)的核苷酸，垂直線代表對(duì)稱軸或ABN’B’A’A’B’NBA或ABB’A’A’B’BA回文序列：指在雙鏈DNA序列中按確定的方向閱讀，雙鏈中的每一條鏈的序列都是相同的?，F(xiàn)在是20頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二二重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱EcoRIGAATTCCTTAAGHindIIIAAGCTTTTCGAA現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過(guò)互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新環(huán)化起來(lái)。平末端的DNA片段則不易于重新環(huán)化。現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二5’…G-C-T-G-OHP--A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’EcoRI的切割位點(diǎn)1：5’粘性末端：突出的單鏈末端為5’端（5’P）2：3’粘性末端：突出的單鏈末端為3’端（3’OH）5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G

…3’3’…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI的切割位點(diǎn)現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二5’…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’PvuII的切割位點(diǎn)3：平末端：無(wú)突出的單鏈現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二非對(duì)稱AccBSICCGCTCGGCGAG現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二識(shí)別序列出現(xiàn)頻率1/4n4Nt=44=2566Nt=46=4096現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二稀切酶（rarecuttingenzymes）在DNA分子中出現(xiàn)的幾率低，故稱之為稀切酶識(shí)別序列：比較長(zhǎng)；富含AT；富含GC現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二同裂酶(isoschizomer)酶來(lái)源不同，但具有相同的識(shí)別序列（切割位點(diǎn)可相同，也可不同）切割位點(diǎn)不同，是不同的酶切割位點(diǎn)相同，是相同的酶，來(lái)自不同生物現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二同尾酶（isocaudamer）來(lái)源各異，識(shí)別的靶序列也不相同，但切割后的DNA片段具有相同的黏性末端，這樣的一組限制性內(nèi)切酶稱為同尾酶?，F(xiàn)在是29頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二2.6切割位點(diǎn)DNA在限制性內(nèi)切酶的作用下，使多聚核苷酸上磷酸二酯鍵斷開(kāi)的位置EcoRIICCWGG

10(N)CGA(N)6TGC(N)12部分在兩翼少數(shù)兩側(cè)/端多數(shù)在內(nèi)部現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二偏愛(ài)位點(diǎn)P42切割位點(diǎn)兩側(cè)序列的核苷酸組成亦與切割效率有關(guān)，即某些限制酶對(duì)同一介質(zhì)中的有些位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛(ài)性切割現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二2.7反應(yīng)系統(tǒng)底物：純，線性，有保護(hù)序列酶：樣品，識(shí)別序列的密度，容積活性反應(yīng)緩沖液反應(yīng)條件現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mMVolume20--100μl反應(yīng)溫度、時(shí)間37℃，1--1.5hr0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二1）DNA純度：要求較純因素：蛋白質(zhì)、乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿以及某些高濃度金屬離子措施：增加酶的用量；擴(kuò)大反應(yīng)系統(tǒng)體積延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間；添加亞精胺2.7.1底物現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二2)DNA的甲基化程度核酸內(nèi)切限制酶是原核生物限制—修飾體系的組成部分，因此識(shí)別序列中特定核苷酸的甲基化作用，便會(huì)強(qiáng)烈地影響酶的活性。為避免產(chǎn)生這樣的問(wèn)題，在基因克隆中，質(zhì)粒DNA是來(lái)源于甲基化酶缺陷型的大腸桿菌菌株。這樣制備的質(zhì)粒DNA，其中的內(nèi)切酶識(shí)別序列沒(méi)有甲基化，不受限制。現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二3）DNA分子構(gòu)型

效率：線性DNA分子

大于超螺旋質(zhì)粒DNA環(huán)狀病毒DNA現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二4）識(shí)別序列的側(cè)面序列

限制酶切割DNA，對(duì)識(shí)別序列兩側(cè)的非識(shí)別序列有長(zhǎng)度要求，只含識(shí)別序列的寡核苷酸是不會(huì)被酶切的，故通常要在識(shí)別序列兩側(cè)多加若干個(gè)核苷酸現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二試劑公司提供的包裝說(shuō)明書(shū)會(huì)標(biāo)明酶活性單位數(shù)和容積活性，最佳作用條件2.7.2內(nèi)切酶決定酶的用量酶本身的催化活性底物DNA的樣品1.用量現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二2酶活單位1個(gè)酶活單位：在最適反應(yīng)條件下，在20l反應(yīng)液中反應(yīng)1小時(shí)，使1gDNA（標(biāo)準(zhǔn)DNA）完全消化所需的酶活性稱為1個(gè)單位。（教材P43）1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1μg標(biāo)準(zhǔn)DNA（λDNA

）所需的酶量容積活性：1μL酶液中具有的酶活性單位，即U/μL。Q：某公司產(chǎn)品——內(nèi)切酶a標(biāo)注為200U/μL，現(xiàn)有提取到50ug的λDNA，問(wèn)：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，需要多少體積的內(nèi)切酶a？現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二常規(guī)緩沖液pH，Mg++，DTT/β-ME，(10X)pH7.0-7.9(at25℃)Tris-HCl，乙酸離子強(qiáng)度：NaCl高中低100mM50mM0③Mg++10mMMgCl2，MgAc2.7.3反應(yīng)緩沖液對(duì)絕大多數(shù)限制酶來(lái)說(shuō)，在pH=7．4的條件下，其功能最佳?，F(xiàn)在是40頁(yè)\一共有46頁(yè)\編輯于星期二大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是37℃一部分為50-65℃少數(shù)25-30℃高溫作用酶于37℃時(shí)活性多數(shù)10-50%

TaqI(65℃)10%，ApoI(50℃)50%銷售商在產(chǎn)品說(shuō)明中會(huì)標(biāo)明最佳反應(yīng)溫度2.7.4反應(yīng)溫度現(xiàn)