生物反應(yīng)工程試驗講義

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《生物反應(yīng)工程》試驗講義及試驗報告

班級：學(xué)號：姓名：成績：

試驗一游離酶與固定化酶酶學(xué)性質(zhì)比較

試驗?zāi)康模?/p>

把握測定酶動力學(xué)參數(shù)的試驗方法，作圖法計算酶動力學(xué)參數(shù)，把握固定化酶的方法，以及固定化酶后動力學(xué)參數(shù)的變化。

試驗原理：

要建立一個完整的酶動力學(xué)方程，必需要通過動力學(xué)試驗確定其動力學(xué)參數(shù)。對M—M方程，就是要確定rmax和Km值。但直接應(yīng)用M—M方程求取動力學(xué)參數(shù)所遇到的主要困難在于該方程為一非線性方程。為此常將該方程加以線性化，通過作圖法直接求取動力學(xué)參數(shù)。尋常有下述幾種作圖方法。

Lineweaver—Burk法(簡稱L-B法)。將M—M方程取其倒數(shù)得到下式：

1rs?1rmax?Km1rmaxCs(1)

以1／rs對1／Cs作圖可得一直線，該直線斜率為Km／rmax，直線與縱軸交于1／rmax，與橫軸交于一1／Km。此法又稱雙倒數(shù)圖解法。

Hanes—Woo1f法(簡稱H—W法)。將式(1)兩邊均乘以Cs得到

Csrs?Kmrmax?Csrmax(2)

以Cs／rs對Cs作圖，得一斜率為1／rmax的直線，直線與縱軸交點為Km／rmax，與橫軸交點為一Km。

(3)Eadie—Hofstee法(簡稱E-H法)。將M—M方程重排為

rs?rmax?KmrsCs（3）

以rs對rs／Cs作圖，得一斜率為一Km的直線，它與縱鈾交點為rmax，與橫軸交點為rmax／Km。固定化酶亦稱固相酶或水不溶酶。它是通過物理或化學(xué)的方法使溶液酶轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢ǖ目臻g內(nèi)其運動受到完全約束、或受到局部約束的一種不溶于水，但仍具活性的酶。它能以固相狀態(tài)作用于底物進(jìn)行催比反應(yīng)。

固定化酶的主要優(yōu)點是，在催化反應(yīng)以后很簡單從反應(yīng)系統(tǒng)中分開出來，不僅固定化酶可以反復(fù)使用，而且產(chǎn)物不受污染簡單精制，固定化后的酶大多數(shù)狀況下其穩(wěn)定性增加，僅有少數(shù)的穩(wěn)定性下降，固定化酶有一定的形狀和一定的機械強度，可以裝填在反應(yīng)器中長期使用，便于實現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化和自動化。固定化酶的制備方法可分為吸附法、交聯(lián)法、共價法、包埋法四大類。假使固定化酶的動力學(xué)仍聽從M—M方程，則可通過動力學(xué)參數(shù)Km與rmax值的大小來反映酶在固定化前后活性的變化。

儀器與試劑：

分光光度計、水浴鍋、酸性磷酸酯酶、磷酸苯二鈉、酚標(biāo)準(zhǔn)液、碳酸鈉溶液、費林－酚試劑、

２

卡拉膠

試驗步驟及數(shù)據(jù)記錄：

1、酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取9只試管，依照0-8的順序編號，0號為空白管。依照下表的過程進(jìn)行操作：

管號

0.4mmol/L酚標(biāo)準(zhǔn)液蒸餾水

1mol/L碳酸鈉溶液費林－酚試劑A680

00mL120.5

123456780.10.20.30.40.50.60.70.80.90.80.70.60.50.40.30.2222222220.50.50.50.50.50.50.50.535℃顯色10min

2、酶動力學(xué)參數(shù)的求取。取7只試管，依照0-6的順序編號，0號為空白管。依照下表的過程

進(jìn)行操作：℃

管號

5mmol/L磷酸苯二鈉溶液0.2mol/LpH5.6乙酸鹽緩沖液酶液

1mol/L碳酸鈉溶液費林－酚試劑A680

000.50.5

10.10.4

20.150.45

30.20.30.520.5

40.30.20.520.5

50.40.10.520.5

60.500.520.5

0.50.535℃反應(yīng)15min2220.50.50.5

35℃顯色10min

3、酶固定化及動力學(xué)參數(shù)測定。稱取0.8g卡拉膠，溶解在20mL水中，加熱煮沸，冷卻到50-60℃。將在水浴鍋中保溫好的酶液5mL倒入，并攪拌均勻，冷卻，待完全固化后，用5%的KCl溶液浸泡

30min。將浸泡好的固定化酶取出，濾紙吸干，用小刀將其切成3×3mm的小塊。稱取固定化酶5g共6份，取6只50mL三角瓶，依照下表過程操作：

三角瓶號

5mmol/L磷酸苯二鈉溶液0.2mol/LpH5.6乙酸鹽緩沖液

固定化酶

1mol/L碳酸鈉溶液費林－酚試劑A680

0010

119

237

355520.5

473520.5

591520.5

55535℃搖床反應(yīng)15min2220.50.50.5

35℃顯色10min

試驗結(jié)果處理分析：

繪制酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

３

計算游離酶動力學(xué)參數(shù)CsA680酚含量rs1/Cs1/rsCs/rsrs/Cs

計算固定化酶動力學(xué)參數(shù)CsA680酚含量rs1/Cs1/rsCs/rsrs/Cs

４

游離酶和固定化酶酶活力比較：方法游離酶參數(shù)方法固定化酶酶活回收率參數(shù)KmKmL-BrmaxL-BrmaxKm

H-WrmaxH-WKm有效因子rmaxKmKmE-HrmaxE-Hrmax分析和探討：

1、動力學(xué)參數(shù)作圖法求取的方法有那些？分別考慮其誤差來源。（預(yù)習(xí)時填寫）

2、固定化酶的方法有那些？本試驗中采用的方法是什么？有什么優(yōu)點？

５

試驗二用亞硫酸鈉氧化法測定氣液接觸過程

的體積傳質(zhì)系數(shù)ka

L

試驗?zāi)康模?/p>

在非發(fā)酵狀況下，用亞硫酸鈉氧化法來測定發(fā)酵罐通氣或攪拌時的體積傳質(zhì)系數(shù)，從而考察通氣、攪拌等因素對發(fā)酵罐內(nèi)氣液接觸過程的體積傳質(zhì)系數(shù)kLa的影響。

儀器與試劑：

1、發(fā)酵罐（攪拌或氣升式）2、碘量瓶

3、移液管（1mL）

4、燒杯（50mL、2000mL）

-1

5、0.1mol〃L碘液

6、0.1mol〃L-1硫代硫酸鈉（Na2S2O3）溶液7、無水亞硫酸鈉8、硫酸銅

試驗原理

亞硫酸鈉溶液，在銅或鈷離子作為催化劑的作用下，能與液相中的溶解氧迅速反應(yīng)，使亞硫酸根離子氧化為硫酸根離子，其氧化反應(yīng)速度在較大范圍內(nèi)與亞硫酸根離子濃度無關(guān)。由于氧是較難溶解于水的氣體，因而氧的溶解速度要比液相中的氧的消耗速度慢的多，因此氧分子一經(jīng)滲入液相，就馬上被還原，所以可以認(rèn)為，在整個試驗中，液相中的氧濃度可視為零，即有：

Nv?kLa(C?C)?kLaC**

在25℃及0.1MPa下，亞硫酸鈉溶液中，經(jīng)測定C*=0.21mgO2〃L-1。所以從上式可以看出，只要測得Nv值，就可以計算出kLa。

試驗時，在攪拌罐中配制一定濃度的亞硫酸鈉溶液，其體積視發(fā)酵罐的大小而定；在攪拌通氣或通氣狀況下，參與少量催化劑，計時，取不同時刻的試樣與過量的碘溶液作用，多余的碘用表定過的硫代硫酸鈉來滴定，根據(jù)消耗的硫代硫酸鈉溶液的體積，可以計算出單位時間內(nèi)氧的溶解量Nv值。上述過程的反應(yīng)式如下：

2Na2SO3?O2?2Na2SO4Na2SO3?I2?NaSO4?2HI

2NaS2O3?I2?Na2SO4?2NaI試驗步驟：

６

1、發(fā)酵罐清洗，試運轉(zhuǎn)，（對氣升式發(fā)酵罐要確定其最正確裝液量）

2、裝罐試驗：確鑿稱取31.5g亞硫酸鈉，放臵燒杯中，用1L水溶解，待亞硫酸鈉全部溶解后，倒入發(fā)酵罐中；確鑿稱取0.5g硫酸銅并溶解于少量水中，將硫酸銅溶液倒入發(fā)酵罐中；在室溫下，開動攪拌通氣或通氣攪拌，調(diào)理攪拌轉(zhuǎn)速n和通氣量Q；開始計時，每隔一定時間（5min）取樣1mL分析其中的亞硫酸鈉含量（取5個樣），測定其中的亞硫酸鈉含量。調(diào)理通氣量或攪拌轉(zhuǎn)速，重復(fù)上面的試驗，要求改變試驗條件，做3個條件試驗。

數(shù)據(jù)記錄：

試驗結(jié)果記錄表時間(min)5條件轉(zhuǎn)速：氣量：轉(zhuǎn)速：氣量：轉(zhuǎn)速：氣量：轉(zhuǎn)速：氣量：轉(zhuǎn)速：氣量：轉(zhuǎn)速：氣量：依照記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖：10152025

數(shù)據(jù)處理：

７

依照上面的數(shù)據(jù)，計算Nv和kLa轉(zhuǎn)速：氣量：?V/?tNv（）kLa（）條件轉(zhuǎn)速：氣量：轉(zhuǎn)速：氣量：轉(zhuǎn)速：氣量：轉(zhuǎn)速：氣量：轉(zhuǎn)速：氣量：繪制轉(zhuǎn)速n和kLa關(guān)系圖，或氣量Q和kLa關(guān)系圖

分析和探討：

3、探討分析轉(zhuǎn)速、通氣量、亞硫酸鈉濃度等因素對發(fā)酵罐體積傳質(zhì)系數(shù)kLa的影響，如何根據(jù)測定數(shù)據(jù)計算氧消耗速率Nv和體積傳質(zhì)系數(shù)kLa；（預(yù)習(xí)時填寫）

4、試分析試驗過程中的主要誤差來源，并提出今后試驗改進(jìn)的看法。

８

試驗三微生物反應(yīng)器的反應(yīng)性能試驗

試驗?zāi)康模?/p>

進(jìn)一步了解和把握生物反應(yīng)器BSTR和CSTR的反應(yīng)性能，了解和把握微生物菌體在反應(yīng)器中生長的規(guī)律，并了解反應(yīng)器的有關(guān)操作。

試驗原理：

間歇攪拌釜式反應(yīng)器是一類常用的微生物反應(yīng)器。其主要特征是分批進(jìn)料和卸料，因此其操作試劑由兩部分組成：一是進(jìn)行反應(yīng)所需的時間，即開始進(jìn)行反應(yīng)直至達(dá)到所要求的反應(yīng)程度為止所需的時間。由于攪拌的作用，反應(yīng)器內(nèi)的物料充分混合，濃度均勻，反應(yīng)器內(nèi)物系的組成僅隨反應(yīng)時間而變。對于菌體濃度而言，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，微生物菌體的濃度不斷增加，其菌體濃度變化的規(guī)律基本上符合Monod方程。連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器也是一類微生物反應(yīng)器，其反應(yīng)性能和間歇反應(yīng)器有明顯的不同。其主要特征是，反應(yīng)物連續(xù)穩(wěn)定地參與到反應(yīng)器中，同時反應(yīng)產(chǎn)物也連續(xù)穩(wěn)定地流出反應(yīng)器，并保持反應(yīng)體積不變。當(dāng)反應(yīng)器操作達(dá)到穩(wěn)定時，反應(yīng)器內(nèi)物系的組成不隨時間而變，同時由于反應(yīng)器內(nèi)的攪拌，使得物系在空間上達(dá)到充分混合，物系組成也不隨空間位臵而變，此時反應(yīng)器內(nèi)物系的組成和反應(yīng)器出口的組成一致。對應(yīng)于一定的進(jìn)料流量，反應(yīng)器內(nèi)的物系有一定的組成，對于菌體濃度而言，隨著流量的增大，菌體濃度變小，當(dāng)進(jìn)料流量達(dá)到一定值時，反應(yīng)器內(nèi)的菌體濃度可以為零，這時稱為反應(yīng)器操作的洗出點。

設(shè)備和試劑

1、微生物反應(yīng)器2、可見分光光度計

3、微型計量泵（蠕動泵）4、酒精酵母種子培養(yǎng)液5、葡萄糖

試驗步驟：

1、反應(yīng)培養(yǎng)基配制：

培養(yǎng)基配方：葡萄糖20g/L、硫酸銨4g/L、蛋白胨5g/L、磷酸二氫鉀1g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈣0.2g/L、酵母膏1g/L2、反應(yīng)器反應(yīng)性能試驗：A：間歇反應(yīng)試驗：

參與一定體積的反應(yīng)培養(yǎng)基，按10%的接種量參與酒精酵母種子液。30℃，控制一定的攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量進(jìn)行反應(yīng)。每隔半小時，取一定量的反應(yīng)液，測定其OD值。B：連續(xù)反應(yīng)試驗：

在間歇反應(yīng)一定時間后，控制反應(yīng)器內(nèi)的反應(yīng)體積在一較小值，在間歇反應(yīng)條件下，用蠕動泵連續(xù)參與培養(yǎng)基，并控制出料閥門，使出料量等于進(jìn)料量，以維持反應(yīng)器內(nèi)的液面位臵不變，這時反應(yīng)器在某一稀釋率下進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。當(dāng)一定時間后連續(xù)反應(yīng)達(dá)到

９

穩(wěn)定時，取樣分析反應(yīng)液的OD值。調(diào)理進(jìn)料流量和出料流量，使連續(xù)反應(yīng)器在另一稀釋率下反應(yīng)。流量的調(diào)理是從小到大，直至某一流量下反應(yīng)器的操作達(dá)到洗出，完成試驗。

分析方法：

取5mL反應(yīng)液，用水稀釋50mL，用水作為對比，在可見分光光度計上在540nm處測定其OD值。

數(shù)據(jù)記錄：

時間CglucoseOD0間歇試驗結(jié)果記錄表1.02.03.04.04.55.05.56.0間歇試驗結(jié)果記錄表0.40.60.830min40min30min40min30min40min稀釋率CglucoseOD數(shù)據(jù)處理：

1、間歇反應(yīng)菌體濃度隨時間變化的曲線和連續(xù)反應(yīng)菌體濃度隨加料流量變化曲線，

１０

2、根據(jù)圖中數(shù)據(jù)計算：μ(1h)μ(3h)μ(6h)μmaxKs分析和探討：

1、間歇培養(yǎng)過程中遲滯期的長短如何調(diào)整？如何判斷連續(xù)培養(yǎng)中洗出點？（預(yù)習(xí)時填

寫）

2、經(jīng)試驗數(shù)據(jù)可知，在連續(xù)培養(yǎng)過程中，什么狀況下達(dá)到最正確稀釋率？洗出點的稀釋率為多少？

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試驗四停留時間分布的測定

試驗?zāi)康模?/p>

采用示蹤法測定反應(yīng)器的停留時間分布，了解發(fā)酵罐內(nèi)流體的混合特性，有利于發(fā)酵罐的設(shè)計和操作。

試驗原理：

停留時間分布理論不僅是化學(xué)反應(yīng)和生化反應(yīng)工程學(xué)科的臵要組成部分，而且還廣泛用于吸收、萃取、蒸餾和結(jié)晶等分開過程與設(shè)備的設(shè)計及其模擬，以及其它涉及滾動系統(tǒng)的領(lǐng)域。對于連續(xù)反應(yīng)器，由于流體在系統(tǒng)中流速分布的不均勻、流體的分子擴(kuò)散和湍流擴(kuò)散、攪拌引起的強制對流，以及由于反應(yīng)器的設(shè)計加工和安裝不良而產(chǎn)生的死區(qū)、溝流和短路等原因，使得流體粒子在系統(tǒng)中的停留時間有長有短，有些物料過于很快離開了反應(yīng)器，有些粒子則經(jīng)歷很長的一般時間后才離開，停留時間分布更加繁雜。

物料粒子在反應(yīng)器內(nèi)的停留時間分布是一個隨機過程。對隨機過程可用描述概率分布的方法來描述物料粒子的停留時間分布，即停留時間分布密度函數(shù)和停留時間分布函數(shù)。

停留時間分布的試驗測定方法是示蹤應(yīng)答法，用示蹤劑跟蹤流體在系統(tǒng)內(nèi)的停留時間。根據(jù)示蹤劑參與方式的不同，可分為脈沖法、階躍法和周期輸入法。其中：

脈沖法是在設(shè)備內(nèi)流體滾動達(dá)到穩(wěn)定之后，在一短的時間內(nèi)，在系統(tǒng)入口處向流進(jìn)系統(tǒng)的流體參與一定量的示蹤劑，同時在出口處檢測流出物料中示蹤劑濃度隨時間的變化。對于試驗中采集的離散型數(shù)據(jù)，可采用下式進(jìn)行計算停留時間分布密度函數(shù)：

階躍法是將系統(tǒng)中作穩(wěn)態(tài)滾動的流體切換為流量一致的含有示蹤劑的流體，或者相反。前一種稱為升階法；后一種稱為降階法。階躍法與脈沖法的根本區(qū)別是前者連續(xù)向系統(tǒng)參與示蹤劑，一直到試驗測定終止，而后者則是在一段短的時間內(nèi)參與全部示蹤劑。對于試驗中采集的離散型數(shù)據(jù)，可采用下式進(jìn)行計算停留時間分布函數(shù)：

儀器與試劑：

1、微生物反應(yīng)器2、可見分光光度計

3、微型計量泵（蠕動泵）

4、羅丹明B溶液（0.01g/mL）

試驗步驟：

一、脈沖法測定:

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1、測定蠕動泵流量，確定反應(yīng)器內(nèi)溶液體積（VR=30×V0）和反應(yīng)器出口流量。2、調(diào)理反應(yīng)器出口流量，保持進(jìn)出流量一致。

3、待達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，將0.01g/mL的羅丹明B溶液1mL迅速倒入，開始計時。4、每隔5min取樣測定光密度，總共測定2h。二、階躍法測定：

1、清洗反應(yīng)器后，在反應(yīng)器中參與一致量清水，開啟攪拌（300r/min）。2、調(diào)理蠕動泵，保持進(jìn)出流量一致。

-5

3、待達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，將泵進(jìn)口接到10g/mL的羅丹明B溶液中，待溶液剛滴入反應(yīng)器時開始計時。

4、每隔5min取樣測定光密度，總共測定2h。

試驗記錄：

脈沖法時間（min）OD時間（min）OD階躍法時間（min）56056010651065157015