時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)資料

時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)資料第1頁(yè)/共27頁(yè)標(biāo)記免疫學(xué)分析技術(shù)發(fā)展歷程免疫熒光分析(Coons,1941)放射免疫分析(Berson和Yalow,1960)酶免ELISA(Engvall,1971)金標(biāo)免疫分析(Faulk和Taylor,1971)化學(xué)發(fā)光免疫分析(Arakawa，1977)時(shí)間分辨熒光免疫分析(Soini和Hemmila，1979)電化學(xué)發(fā)光免疫分析(Leland,1990)液相芯片(美國(guó)Luminex公司,1997)第2頁(yè)/共27頁(yè)①免疫熒光②放射免疫④化學(xué)發(fā)光⑥電化學(xué)發(fā)光

⑤時(shí)間分辨熒光③酶聯(lián)免疫第3頁(yè)/共27頁(yè)標(biāo)記免疫技術(shù)的理論檢測(cè)靈敏度放射免疫 10-10-10-12mol酶聯(lián)免疫 10-9-10-10mol化學(xué)發(fā)光 10-15mol時(shí)間分辨熒光10-18mol電化學(xué)發(fā)光 10-18mol第4頁(yè)/共27頁(yè)一、時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）

（Time-resolvedfluorescenceimmunoassay）

背景介紹基本原理技術(shù)特點(diǎn)反應(yīng)模式第5頁(yè)/共27頁(yè)背景介紹1979年，芬蘭Wallac公司研發(fā)部的Soini

和Hemmila首次提出了建立稀土離子標(biāo)記物的“時(shí)間分辨熒光免疫分析”理論1983年，Soini和Kojola首先開(kāi)發(fā)出以鑭系元素為示蹤物的時(shí)間分辨熒光測(cè)量?jī)x，建立了新的非放射性微量分析檢測(cè)技術(shù)。同一年，

Pettersson等人運(yùn)用此儀器首次對(duì)人絨膜促性腺激素

(hCG)進(jìn)行了時(shí)間分辨熒光免疫分析1984年，Hemmila確定了DELFIA(DissociationEnhancedLanthanideFluoroimmunoassay)這種時(shí)間分辨免疫分析技術(shù)方案,從而使DELFIA成為Wallac的專(zhuān)利技術(shù)1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis創(chuàng)立了一種不同于DELFIA

的時(shí)間分辨熒光免疫分析，即FIAgen2003年，時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)獲國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)第6頁(yè)/共27頁(yè)基本原理三價(jià)稀土離子包括有銪(Eu)，釤（Sm)，鋱

(Tb)，鏑

(Dy)

等，它們的熒光光譜具有特異性強(qiáng)﹑Stokes位移大﹑壽命長(zhǎng)的特點(diǎn)DELFIA采用異硫氰酸芐基二亞乙基三胺四乙酸銪(DTTA-Eu)

為雙功能螯合試劑，其一端螯合Eu3+，另一端可與蛋白質(zhì)的-NH2

連接。在中性或接近中性pH條件下，DTTA與Eu3+具有足夠的螯合穩(wěn)定性，而在增強(qiáng)液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu又能將螯合的Eu3+迅速、徹底地釋放出來(lái)并與增強(qiáng)液中的配體螯合﹑進(jìn)入膠束的疏水內(nèi)核，使Eu3+熒光得以成千萬(wàn)倍地放大FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA為標(biāo)記物，通過(guò)檢測(cè)其與過(guò)量Eu3+形成的螯合物熒光進(jìn)行定量。由于

BCPDA的可檢測(cè)性不夠理想，F(xiàn)IAgen需要利用生物素-

親合素信號(hào)放大來(lái)彌補(bǔ)BCPDA檢測(cè)靈敏度的不足第7頁(yè)/共27頁(yè)DELFIA標(biāo)記技術(shù)堿性第8頁(yè)/共27頁(yè)時(shí)間:(μs）04008001000340nm激發(fā)光第二個(gè)循環(huán)熒光短壽命熒光613nm長(zhǎng)壽命熒光延遲時(shí)間測(cè)值時(shí)間通過(guò)時(shí)間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光分辨開(kāi)來(lái)，使理論本底達(dá)到0第9頁(yè)/共27頁(yè)300400500600熒光強(qiáng)度激發(fā)光發(fā)射光波長(zhǎng)(nm)第10頁(yè)/共27頁(yè)TbDyEuSm500發(fā)射光強(qiáng)度2004000延遲時(shí)間(μs)600發(fā)射光波長(zhǎng)(nm)500發(fā)射光強(qiáng)度0延遲時(shí)間(μs)第11頁(yè)/共27頁(yè)TRFIA技術(shù)特點(diǎn)極長(zhǎng)的熒光衰退時(shí)間

銪：730000ns

Stokes位移大

銪：激發(fā)光340nm，發(fā)射光613nm狹窄的發(fā)射峰解離-增強(qiáng)技術(shù)可使其熒光性提高100萬(wàn)倍第12頁(yè)/共27頁(yè)固相包被抗體銪標(biāo)記抗體孵育Eu待測(cè)抗原++EuEu+增強(qiáng)液+Eu雙抗體夾心法示意圖第13頁(yè)/共27頁(yè)雙抗原夾心法示意圖Eu++孵育+Eu孵育增強(qiáng)液+Eu固相包被抗原待測(cè)抗體銪標(biāo)記抗原第14頁(yè)/共27頁(yè)中和法示意圖(回滴定法)++孵育+Eu孵育EuEu增強(qiáng)液++Eu待測(cè)抗體銪標(biāo)記抗體中和抗原第15頁(yè)/共27頁(yè)小分子抗原競(jìng)爭(zhēng)抑制示意圖固相包被二抗+孵育++Eu孵育Eu待測(cè)抗原銪標(biāo)抗原Eu增強(qiáng)液++Eu一抗第16頁(yè)/共27頁(yè)時(shí)間分辨技術(shù)重點(diǎn)和難點(diǎn)固定相（96孔板）標(biāo)準(zhǔn)品銪標(biāo)記物第17頁(yè)/共27頁(yè)二、時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）

測(cè)試儀第18頁(yè)/共27頁(yè)目前的TRFIA測(cè)試儀：國(guó)外儀器（Wallac公司<PerkinElmer>）國(guó)內(nèi)其他公司生產(chǎn)的儀器(上海新波、廣州豐華等)達(dá)瑞抗體公司自主研發(fā)的儀器及軟件（DR-M6601）第19頁(yè)/共27頁(yè)WallacAutoDELFIA1235第20頁(yè)/共27頁(yè)半自動(dòng)VICTOR21420第21頁(yè)/共27頁(yè)半自動(dòng)ANYTEST2000第22頁(yè)/共27頁(yè)DR-M6601時(shí)間分辨熒光免疫分析儀【粵食藥管械（準(zhǔn)）字2005第2400226】第23頁(yè)/共27頁(yè)達(dá)瑞公司開(kāi)發(fā)的系列TRF試劑內(nèi)分泌科檢查甲狀腺系列：T3、T4、FT3、FT4、TSH、TBG、TG、TGAb、TPoAb糖尿病系列：insulin、C-Peptide

生長(zhǎng)激素：hGH

其他：Cortisol腫瘤科檢查AFP、CEA、tPSA、β2-MG

、hTG、CA-242、CA-724、CA-50

、

fPSA、NSE、cyfra211、CA-199、CA-125、CA153傳染病檢查乙肝系列：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb其他：HCV、HIV婦產(chǎn)科檢查FSH、LH、hCG、Prolactin、Progesterone、SHBG、β-hCG、PAPP-A、Testosterone

、uE3、E2血液科檢查貧血檢查：（Ferritin、VitB12