流式所用的玻璃器皿器械槍尖及試劑均須高壓

流式所用的玻璃器皿器械槍尖及試劑均須高壓第1頁/共44頁第二部分

研究型綜合實(shí)驗(yàn)第2頁/共44頁實(shí)驗(yàn)?zāi)康难芯葵溠刻墙Y(jié)合蛋白（Maltosebindingprotein,MBP)免疫調(diào)節(jié)作用MBP抗腫瘤作用及機(jī)制第3頁/共44頁

小鼠

取脾制備淋巴細(xì)胞懸液

測(cè)腫瘤大小

淋巴細(xì)胞分離ELISPOT

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析、論文書寫流式細(xì)胞術(shù)Lewis肺癌細(xì)胞接種

MBP免疫第4頁/共44頁

材料的準(zhǔn)備

按照每組8只準(zhǔn)備：小鼠：免疫前兩天（11月30日）領(lǐng)C57BL/6（20g左右）雌性小鼠50只。10只1ml注射器，10只滅菌的玻璃小試管。PBS（磷酸鹽緩沖液）30ml。MBP2.4mg通過Amylose親和層析純化。BCG50mg/只兩支。第5頁/共44頁免疫方法：

MBP：50μg/只，BCG：3mg/只，每隔7天免疫一次，第二次免疫不加BCG。鼠頸背部六點(diǎn)，腹股溝二點(diǎn)皮下注射，每只鼠液體總量400μl。免疫日期：11月2日第一次，11月9日第二次。第6頁/共44頁小鼠免疫Group1Group3Group2Group5Group4Group6Group7PBSPBS+MBP第7頁/共44頁腫瘤接種細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇Leiws肺癌細(xì)胞，用IMDM液洗兩次后，在含10%新生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml

鏈霉素的IMDM培養(yǎng)液，5%CO2孵箱37℃培養(yǎng)，收集4.5x107個(gè)細(xì)胞。接種腫瘤細(xì)胞：20只C57小鼠背部皮下注射生理鹽水，

21只注射Leiws肺癌細(xì)胞，2x106/只，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。接種時(shí)間：在第二次免疫后3天注射腫瘤細(xì)胞。第8頁/共44頁Group1：MBP(-)BCG(-)Tumor(-):

編號(hào)G1-1,G1-2,G1-3,G1-4，G1-5，G1-6Group2：MBP(-)BCG(+):

編號(hào)G2-1,G2-2,G2-3,G2-4，G2-5，G2-6

Group3：MBP(+)BCG(-):

編號(hào)G3-1,G3-2,G3-3,G3-4，G3-5，G3-6

Group4：MBP(+)50μg/只BCG(+):

編號(hào)G4-1,G4-2,G4-3，G4-4，G4-5，G4-6Group5：MBP(-)BCG(-)Tumor(+):

編號(hào)G5-1,G5-2,G5-3,G5-4，G5-5，G5-6Group6：MBP(-)BCG(+)Tumor(+):

編號(hào)G6-1，G6-2,G6-3,G6-4，G6-5，G6-6Group7：MBP(+)50μg/只BCG(+)Tumor(+):

編號(hào)G7-1,G7-2,G7-3,G7-4，G7-5，G7-6實(shí)驗(yàn)組及編號(hào)第9頁/共44頁學(xué)生分組與安排實(shí)驗(yàn)共分7個(gè)組，每組6人，每人一只鼠。前3號(hào)做ELISPOT，在超凈臺(tái)內(nèi)操作后3號(hào)做流式細(xì)胞術(shù)并檢測(cè)，在超凈臺(tái)外操作1-4組在211室5-7組在214室，作流式的同學(xué)細(xì)胞加封閉液固定后，回211室。5-7組每組殺完鼠后，分別集中放在3個(gè)塑料袋中收回。ELISPOT操作步驟貼在超凈臺(tái)上。流式細(xì)胞術(shù)操作步驟看幻燈。第10頁/共44頁酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn),Enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT第11頁/共44頁實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^檢測(cè)分泌IFN-γ

的抗原特異性T細(xì)胞頻數(shù)，確定抗原特異性Th1細(xì)胞的活化。第12頁/共44頁實(shí)驗(yàn)原理第13頁/共44頁最靈敏、最有效的直接離體檢測(cè)抗原特異性T和B細(xì)胞的方法?？捎糜跈z測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和細(xì)胞因子分泌細(xì)胞。第14頁/共44頁MBP0.7mg/ml,40μl：配成50μg/mlRPMI164050mlConA50μg/ml200μl細(xì)胞計(jì)數(shù)液(3%醋酸溶液）100ml小鼠：實(shí)驗(yàn)當(dāng)天從動(dòng)物室取回微量移液器20μl，微量移液器高壓滅菌吸水紙1盒細(xì)胞計(jì)數(shù)板14塊，每組兩塊游標(biāo)卡尺1個(gè)廢液缸1個(gè)超凈工作臺(tái)6個(gè)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱注：ELISPOT及流式所用的玻璃器皿、器械槍尖及試劑均須高壓。實(shí)驗(yàn)材料1——共用試劑與器材第15頁/共44頁實(shí)驗(yàn)材料2——

每個(gè)超凈臺(tái)內(nèi)的試劑與器材：1-4組

（211三個(gè)超凈臺(tái)）注：ELISPOT及流式所用的玻璃器皿、器械槍尖及試劑均須高壓。10%FCS+RPMI164050mlX1PBS50mlX1淋巴細(xì)胞分層液3ml，1ml/管分裝入8支玻璃試管中。平皿2個(gè)，每個(gè)人半個(gè)。4個(gè)鑷子，2把剪刀，放入酒精燒杯裝好。200目鋼網(wǎng)4個(gè)，5ml刻度吸管2只毛細(xì)管4只20μl、200μl、1000μl加樣器各兩把20μl、200μl、1000μl加樣器頭各1盒1.5mlEP管一盒記號(hào)筆1支、廢液缸1個(gè)、酒精棉球1盒大小膠帽各兩個(gè)

第16頁/共44頁實(shí)驗(yàn)材料2——

每個(gè)超凈臺(tái)內(nèi)的試劑與器材：5-7組

（214，2個(gè)超凈臺(tái)）10%FCS+RPMI164050mlX1PBS50mlX1淋巴細(xì)胞分層液5ml，1ml/管分裝入5支玻璃試管中。平皿3個(gè)，每個(gè)人半個(gè)。4個(gè)鑷子，2把剪刀200目鋼網(wǎng)6個(gè)，5ml刻度吸管2只，20μl、200μl、1000μl加樣器各兩把20μl、200μl、1000μl加樣器頭各1盒1.5mlEP管一盒記號(hào)筆2支、廢液缸1個(gè)、酒精棉球1盒大小膠帽各兩個(gè)注：ELISPOT及流式所用的玻璃器皿、器械槍尖及試劑均須高壓。第17頁/共44頁進(jìn)入超凈臺(tái)安排（房間211）一組6個(gè)人同時(shí)操作。需要3位教師指導(dǎo)首先平皿、試管做標(biāo)記（寫好編號(hào)）將兩組共用器材放在中間（槍尖盒、剪刀鑷子）磨脾取出細(xì)胞后，將平皿排列整齊放在右側(cè)第一組、第二組進(jìn)入取脾后細(xì)胞離心（第一輪，20分鐘）第三組、四組進(jìn)入繼續(xù)（第二輪，20分鐘）第一組、第二組洗細(xì)胞1次（第三輪，10分鐘）第三組、四組洗細(xì)胞1次（第四輪，10分鐘）第一組、第二組洗細(xì)胞1次（第五輪，10分鐘）第三組、四組洗細(xì)胞1次（第六輪10分鐘）第18頁/共44頁進(jìn)入超凈臺(tái)安排（房間214）一組4個(gè)人同時(shí)操作。需要2位教師指導(dǎo)首先平皿、試管做標(biāo)記（寫好編號(hào)）將兩組共用器材放在中間（槍尖盒、剪刀鑷子）磨脾取出細(xì)胞后，將平皿排列整齊放在右側(cè)第五組、第六組1個(gè)人進(jìn)入取脾（第一輪，20分鐘）第六組2個(gè)人、第7組2個(gè)人進(jìn)入繼續(xù)（第二輪，20分鐘）第七組1個(gè)人取脾、第五組洗滌1次（第三輪，10分鐘）第六組、第7組1個(gè)人洗細(xì)胞1次（第四輪10分鐘）第7組2個(gè)人洗細(xì)胞1次、第五組2人洗細(xì)胞2次（第五輪，10分鐘）第六組、第7組2個(gè)人洗細(xì)胞2次（第六輪10分鐘）第7組1個(gè)人洗細(xì)胞2次（第七輪10分鐘）第19頁/共44頁一、小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離第20頁/共44頁

利用血液中各種細(xì)胞的比重不同，紅細(xì)胞和多核系白細(xì)胞比重1.092，單個(gè)核細(xì)胞為1.070，因此將抗凝血置于比重為1.077左右的分層液上，經(jīng)過一定速度和時(shí)間的離心沉淀，即可分離出較純的單個(gè)核細(xì)胞。淋巴細(xì)胞占90%以上。密度梯度離心法原理第21頁/共44頁根據(jù)比重不同進(jìn)行分離第22頁/共44頁1、處死小鼠，進(jìn)入超凈臺(tái)。2、將裝好1ml淋巴細(xì)胞分層液的玻璃試管編號(hào)，取3mlRMPI1640培養(yǎng)液放入平皿中，放入鋼網(wǎng)。3、取脾臟放在鋼網(wǎng)上研磨，搖動(dòng)平皿，使細(xì)胞充分進(jìn)入液體中，制備細(xì)胞懸液。4、然后用1ml加樣器取2ml脾細(xì)胞懸液輕輕置于分層液上。5、1800轉(zhuǎn)，室溫離心15分鐘。6、用毛細(xì)管吸上清棄去，盡量吸取毛玻璃層，放入1.5mlEP管。7、用1ml加樣器加入PBS1ml懸浮細(xì)胞，1500rpm離心5分鐘.8、在超凈臺(tái)中用1ml槍尖吸取上清棄去，再加入PBS1ml1500rpm離心5分鐘，棄去上清。9、用1ml加樣器加入1ml培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，用200μl加樣器取50μl加入另一EP管中，細(xì)胞計(jì)數(shù)。10、調(diào)細(xì)胞濃度3x106/ml制備1ml細(xì)胞懸液備用。淋巴細(xì)胞分離操作步驟第23頁/共44頁二、接種細(xì)胞第24頁/共44頁操作步驟1、預(yù)包被板活化：加入200μl的RPMI1640培養(yǎng)基,室溫靜置10min，傾倒。（由教師完成）2、加細(xì)胞：每孔加入3x105個(gè)細(xì)胞，100μl/well。設(shè)一組正對(duì)照（ConA），每孔加入50μg/mlConA10μl。每一個(gè)細(xì)胞樣品（同一個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物）要設(shè)一個(gè)負(fù)對(duì)照（不加刺激物），一個(gè)MBP刺激組，50μg/mlMBP10μl（終濃度5μg/ml），整塊板設(shè)一個(gè)背景負(fù)對(duì)照（不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基和所有的檢測(cè)試劑）。按照?qǐng)D示加細(xì)胞（由教員完成）。3、細(xì)胞培養(yǎng)：蓋上板蓋，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h.第25頁/共44頁背景G1-1G1-2G1-3G2-1G2-2G2-3G3-1G3-2G3-3G1-1G1-1G1-1G1-1G1-2G1-2G1-2G1-2G1-3G1-3G1-3G1-3G2-1G2-1G2-1G2-1G2-2G2-2G2-1G2-2G2-3G2-3G2-3G2-3G3-1G3-1G3-1G3-1G3-2G3-2G3-2G3-2G3-3G3-3G3-3G3-3G4-1G4-1G4-1G4-1G4-2G4-2G4-2G4-2G4-3G4-3G4-3G4-3G5-1G5-1G5-1G5-1G5-2G5-2G5-2G5-2G5-3G5-3G5-3G5-3G6-1G6-1G6-1G6-1G6-2G6-2G6-2G6-2G6-3G6-3G6-3G6-3G7-1G7-1G7-1G7-1G7-2G7-2G7-2G7-2G7-3G7-3G7-3G7-3123456789101112ABCDEFGHAg02.551002.5510

02.5510

（μg）只加細(xì)胞不加抗原ConA+Group3Group4Group5Group6Group7Group2Group1第26頁/共44頁第二天：按照說明書操作

（不再需要無菌操作）第27頁/共44頁試劑與器材IFN-γ預(yù)包被試劑盒：Biotinylateantibody（生物素標(biāo)記抗體100μlStreptavidin-HRP（酶聯(lián)親和素）100μlDilutionbufferR(1X)10mlX2,Washingbuffer(50X)10ml（實(shí)驗(yàn)員配制）AEC稀釋液10ml,AECsolutionⅠ500μl,AECsolutionⅡ500μl,AECsolutionIII50μlIFN-γ預(yù)包被96孔板一塊200μl、1000μl加樣器各1把200μl加樣器頭20個(gè)蒸餾水250mlX4（高壓），4度保存?zhèn)溆?ml玻璃試管1支37度5%CO2孵箱吸水紙1盒第28頁/共44頁試劑配制Biotinylateantibody（生物素標(biāo)記抗體）：

100μl+DilutionbufferR10mlStreptavidin-HRP（酶聯(lián)親和素）：

100μl+DilutionbufferR10mlDilutionbufferR(1X):10ml(2只）Washingbuffer(50X)：10ml+蒸餾水

500mlAEC顯色液：10ml（臨用時(shí)配制）

AEC稀釋液

AECsolutionⅠAECsolutionⅡAECsolutionⅢ9ml500μl500μl50μl第29頁/共44頁4、裂解細(xì)胞：傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基。每孔加入200μl冰冷的去離子水，4℃冰箱冰浴10分鐘（低滲法裂解細(xì)胞）。5、洗板：每孔用200μl1×Washingbuffer洗滌7次，每次30秒，并在吸水紙上扣干。6、檢測(cè)抗體孵育：每孔加入100ul稀釋好的生物素標(biāo)記抗體，37℃孵育1h.7、洗板：每孔用200μl1×Washingbuffer洗滌5次，每次30秒，并在吸水之上扣干。8、親和素孵育：每孔加入100μl稀釋好的酶標(biāo)親和素，37℃孵育1h.第30頁/共44頁9、洗板：每孔用200μl1×Washingbuffer洗滌5次，每次30秒，并在吸水紙上扣干。10、顯色：每孔加入100μl的顯色液，室溫避光靜置15-45

分鐘（在20-25℃，顯色25min比較合適）。11、終止：待斑點(diǎn)長(zhǎng)到合適的大小之后，以去離子水洗滌2

遍，終止顯色過程。將板倒扣在吸水紙上，拍干細(xì)小的水珠，之后取下保護(hù)層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30min，讓膜自然晾干。12、肉眼觀察。第31頁/共44頁流式細(xì)胞術(shù)（Flowcytometry)第32頁/共44頁實(shí)驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞CD4+CD8+細(xì)胞亞群。第33頁/共44頁實(shí)驗(yàn)原理采用單克隆抗體技術(shù)和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，并結(jié)合光學(xué)、電學(xué)及計(jì)算機(jī)分析而產(chǎn)生的鑒定和分離細(xì)胞亞群的技術(shù)。又名熒光激活細(xì)胞分類儀（fluorescenceactivatedcellsorter,FACS).第34頁/共44頁基本運(yùn)作程序1、細(xì)胞與激光束相交而產(chǎn)生光信號(hào)2、光信號(hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào)3、光信號(hào)數(shù)字化，計(jì)算機(jī)處理第35頁/共44頁ForwardscatterSidescatterHistogram直方圖Dotblot散點(diǎn)圖第36頁/共44頁每組的試劑與器材：1-4組（211）注：流式所用的玻璃器皿、器械槍尖及試劑均須高壓。平皿2個(gè)，每個(gè)人半個(gè)。4個(gè)鑷子，2把剪刀，放入酒精燒杯裝好。200目鋼網(wǎng)4個(gè)，毛細(xì)管4只20μl、200μl、1000μl加樣器各兩把20μl、200μl、1000μl加樣器頭各1盒1.5mlEP管一盒記號(hào)筆2支、廢液缸1個(gè)、酒精棉球1盒淋巴細(xì)胞分層液3ml，1ml/管分裝入3支玻璃試管中。10%FCS+RPMI164050mlX1PBS50mlXX12%多聚甲醛3mlFACS液30ml玻璃試管6支，吸水紙若干第37頁/共44頁每組的試劑與器材：5-7組（214）平皿3個(gè)，每個(gè)人半個(gè)4個(gè)鑷子，2把剪刀200目鋼網(wǎng)6個(gè)，5ml刻度吸管5只，吸球2個(gè)淋巴細(xì)胞分層液5ml，1ml/管分裝入5支玻璃試管中20μl、200μl、1000μl加樣器各兩把20μl、200μl、1000μl加樣器頭各1盒1.5mlEP管一盒記號(hào)筆2支、廢液缸1個(gè)、酒精棉球1盒10%FCS+RPMI164050mlX1PBS50mlX12%多聚甲醛3mlFACS液50ml玻璃試管6支帶蓋冰盒1個(gè)，試管架1個(gè)，吸水紙若干注：流式所用的玻璃器皿、器械槍尖及試劑均須高壓。第38頁/共44頁FITC-抗CD420μlFITC-抗CD820μlPE-抗CD340μl10ml玻璃試管4支EP管4個(gè)10uL\200uL加樣器各1把10uL\200uL加樣器頭各1盒離心機(jī)1臺(tái)漩渦攪拌器1臺(tái)流式細(xì)胞儀1臺(tái)注：ELISPOT及流式所用的玻璃器皿、器械槍尖及試劑均須高壓。共用試劑器材第39頁/共44頁試劑配制

2%多聚甲醛50ml：1g多聚甲醛加入50mlPBS中，4℃保存。用時(shí)稀釋至0.5%。FACS液（含2%胎牛血清+0.1%疊蛋鈉的PBS）250ml胎牛血清5ml，疊蛋鈉0.25g溶于250mlPBS中，4℃保存。第40頁/共44頁實(shí)驗(yàn)分組7個(gè)組中每組4、5、6號(hào)在超凈臺(tái)外做。每人2支玻璃試管,一支做CD4管，另一支做CD8管。在每只試管上標(biāo)記編號(hào),如G1-4CD4,G1-4CD8.4只試管，標(biāo)好空白、CD3,CD4,C