流式細(xì)胞術(shù)的原理

流式細(xì)胞術(shù)的原理第1頁/共42頁流式細(xì)胞術(shù)的原理第2頁/共42頁概念Definition流式細(xì)胞術(shù)Flowcytometry(FCM)特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析檢測(cè)的對(duì)象主要是各種生物顆粒，包括大量的臨床樣本：外周血，骨髓，細(xì)胞穿刺液，洗脫液，實(shí)體組織，同時(shí)包括各種各樣的科研研究對(duì)象：培養(yǎng)細(xì)胞，藻類、染色體、原生動(dòng)物cellsuspension細(xì)胞懸液在流動(dòng)的狀態(tài)中被檢測(cè)各項(xiàng)特性第3頁/共42頁流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)以及原理第4頁/共42頁流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)以及工作原理雖然每款流式細(xì)胞儀有各自的特征性結(jié)構(gòu)，但是其內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本組成相同?；窘Y(jié)構(gòu)一共分三部分：液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)電子系統(tǒng)第5頁/共42頁液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)包括流動(dòng)室flowchamber液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid鞘液三大作用：避免堵塞噴孔約束樣本位于噴嘴中心、提高測(cè)量精度保持細(xì)胞活性第6頁/共42頁液流系統(tǒng)對(duì)靈敏度要求不是很苛刻的實(shí)驗(yàn)，可調(diào)高樣本進(jìn)樣速率，從而提高采樣分析速度。第7頁/共42頁光學(xué)系統(tǒng)主要由激發(fā)光源、光束成形及收集系統(tǒng)組成

弧光燈：氙燈、高壓汞燈價(jià)格便宜激發(fā)光譜廣但是單色性差-單一譜線上能量弱穩(wěn)定性差-功率不穩(wěn)定激光器：氣體激光器：氬離子（488nm）、氦氖（633nm）、氪離子（647nm）、氪氬（568nm）半導(dǎo)體激光器：價(jià)格低、結(jié)構(gòu)簡單、使用壽命長。BDFACSCalibur采用的635nm染料激光器第8頁/共42頁光學(xué)系統(tǒng)激光器：單波長、高能量、發(fā)散角小、高穩(wěn)定性光照第9頁/共42頁光學(xué)系統(tǒng)激光在檢測(cè)細(xì)胞樣本前經(jīng)過透鏡聚焦成為非常窄的高能量光束。激光光束的橫截面呈橢圓形光斑，所以除了集聚能量（細(xì)胞通過檢測(cè)區(qū)時(shí)就可以得到很強(qiáng)的信號(hào)），這樣還可以避免照射到其他細(xì)胞造成干擾。激光光束成形-透鏡聚焦第10頁/共42頁光學(xué)系統(tǒng)收集系統(tǒng)

如何將混合的熒光區(qū)分開來，分別進(jìn)行收集呢？濾光片置于熒光探測(cè)器前，限定其接收的熒光的波長范圍第11頁/共42頁光學(xué)系統(tǒng)第12頁/共42頁電子系統(tǒng)第13頁/共42頁流式細(xì)胞儀的工作原理第14頁/共42頁散射光信號(hào)前向角散射光（FSC，F(xiàn)orwardScatter）：細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC，SideScatter）：細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞核相對(duì)復(fù)雜性第15頁/共42頁散射光信號(hào)第16頁/共42頁熒光信號(hào)特異熒光信號(hào)背景信號(hào)第17頁/共42頁熒光素什么是熒光及熒光素？某些物質(zhì)在特定波長范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長比照射光波長長的光線-即熒光。而這些受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱為熒光素。什么是熒光發(fā)生機(jī)理？室溫下的熒光素分子大部分處于穩(wěn)定的“基態(tài)”。當(dāng)熒光素在激發(fā)光的照射下吸收足夠的光能后，躍遷到新的狀態(tài)，即“激發(fā)態(tài)”。處于激發(fā)態(tài)的熒光分子極不穩(wěn)定，它可以通過極短時(shí)間（納秒）內(nèi)以發(fā)射一定波長的光量子的方式釋放所吸收的能量從而返回到基態(tài)。這一過程稱為熒光發(fā)射，也就是發(fā)光。第18頁/共42頁熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜所有的熒光素都有兩個(gè)特征光譜。激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：-是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。-我們一般標(biāo)注的是吸收波峰，也就是最大吸收波長：Ex-Max發(fā)射光譜（Emission，Em）：-是指熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光。所有熒光都是寬譜發(fā)射。-一般標(biāo)注的是發(fā)射波峰，即最大發(fā)射波長：Em-Max第19頁/共42頁FITC的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料FITC可被488nm激光激發(fā)，Em-Max：525nm，可以配用530/30接收通道488nm525nm第20頁/共42頁P(yáng)I的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料PI同樣可被488nm激光激發(fā)，Em-Max：625nm，所以配用不同的585/42接收通道488nm625nm第21頁/共42頁APC的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料APC可被633nm激光激發(fā)，Em-Max：660nm，可以配用660/20接收通道633nm660nm第22頁/共42頁熒光染料的選擇儀器配置：激光器種類；光信號(hào)接收通道；減少發(fā)射光光譜重疊第23頁/共42頁補(bǔ)償——熒光染料寬譜發(fā)射的特征產(chǎn)生補(bǔ)償問題?！狿E滲漏到FITC通道的信號(hào)FL1-x%FL2—FITC滲漏到PE通道的信號(hào)FL2-x%FL1第24頁/共42頁先電壓，后補(bǔ)償雙色染色的實(shí)驗(yàn)中先使用陰性管調(diào)電壓陰性對(duì)照（1）：細(xì)胞加上IgG1FITC,IgG1PE然后用單染管調(diào)補(bǔ)償單染管（2）：細(xì)胞+抗體AFITCor抗體BPE第25頁/共42頁調(diào)電壓

-尋找目標(biāo)細(xì)胞群;-多色實(shí)驗(yàn)中，分出陰陽性細(xì)胞群分界線調(diào)閾值-減少背景信號(hào)調(diào)補(bǔ)償-減去干擾信號(hào)調(diào)節(jié)電壓、閾值、補(bǔ)償?shù)?6頁/共42頁調(diào)整熒光接收器電壓電壓改變對(duì)數(shù)據(jù)顯示的影響第27頁/共42頁數(shù)據(jù)存儲(chǔ)ListMode列表模式：每個(gè)細(xì)胞的參數(shù)依次按順序排列存儲(chǔ)

FSCSSCFL1FL2EVENVENT210020024540EVENT3300600100700FITC/PE雙染樣本第28頁/共42頁數(shù)據(jù)顯示二維點(diǎn)圖（DotPlot）直方圖（Histogram）等高線圖（ContourPlot）密度圖（Density）三維圖（3DPlot）等·第29頁/共42頁樣本收集及處理制備單細(xì)胞懸液免疫熒光染色表型測(cè)定統(tǒng)計(jì)學(xué)分析流式細(xì)胞術(shù)操作流程第30頁/共42頁1.樣本制備第31頁/共42頁樣本來源血液骨髓淋巴結(jié)體液（尿液、腦脊液、胸腹腔積液）灌洗液（肺泡支氣管）加抗凝劑（EDTA），室溫保存，24h內(nèi)實(shí)體組織機(jī)械法制備單細(xì)胞懸液，保持抗原活性，不宜用酶、表面活性劑第32頁/共42頁2.免疫熒光染色第33頁/共42頁染色方式的選擇直接染色—

標(biāo)有熒光染料的抗體直接特異結(jié)合目標(biāo)抗原?！走x的方式：方便快捷、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、非特異結(jié)合少間接染色—標(biāo)有熒光染料的二抗間接特異結(jié)合目標(biāo)抗原。—在直接染色不能實(shí)現(xiàn)的情況下，選用的方式：非特異性結(jié)合相對(duì)增加。在流式試劑日益全面的情況下，越來越少的客戶選擇這種方式。僅適用于研究最新發(fā)現(xiàn)抗原的客戶。第34頁/共42頁熒光染料的選擇1，首先，了解目標(biāo)抗原1）細(xì)胞表面抗原2）細(xì)胞內(nèi)或是核內(nèi)抗原（固定、透膜步驟）3）以上兩者兼?zhèn)?。先?biāo)記表面抗原，固定后，破膜標(biāo)記胞內(nèi)抗原。4）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的測(cè)定。使用細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑，如monensin、BFA，使得細(xì)胞因子不能分泌到細(xì)胞外。（活化、固定、透膜）2，了解熒光染料及其工作原理，做出準(zhǔn)確的選擇。第35頁/共42頁熒光染料的種類熒光染料分為三大類1.小分子化合物：FITC、PacificBlue2.大分子熒光蛋白：AmCyan，PerCP，PE,APC3.串聯(lián)染料：

PerCP-Cy5.5，PE-Cy5第36頁/共42頁如何正確選擇與使用熒光素儀器配置：有哪些激光器與接收通道多色實(shí)驗(yàn)中，盡量減少熒光素之間的相互干擾—

如APC與Cy5不能串聯(lián)使用，兩者光譜重疊大，補(bǔ)償不好調(diào)。盡量選擇應(yīng)用廣、亮度高的熒光素—

熒光素的強(qiáng)弱用StainIndex染色指數(shù)來表示，數(shù)值越大，信噪比越高。多色實(shí)驗(yàn)中，亮度高的熒光素搭配表達(dá)量低的目標(biāo)抗原—

例如，PE，APC這類大分子蛋白相對(duì)亮度高。關(guān)注F/P比值—

尤其是使用小分子熒光素，一個(gè)抗體上會(huì)標(biāo)記多個(gè)熒光素分子。在細(xì)胞本身自發(fā)熒光強(qiáng)的情況下，使用發(fā)射光波長大于600nm的熒光染料。避免使用串聯(lián)染料，不穩(wěn)定，可能發(fā)生降解。第37頁/共42頁BD網(wǎng)站提供每一種熒光素的激發(fā)以及發(fā)射光譜第38頁/共42頁常用的熒光素組合第39頁/共42頁臨床應(yīng)用HIV診斷與治療白血病和淋巴瘤的免疫