流行性腦脊髓膜炎實驗室診斷

流行性腦脊髓膜炎實驗室診斷第1頁/共34頁何謂流行性腦脊髓膜炎？流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦），是由腦膜炎奈瑟菌（Neisseriameningitides，Nm）通過呼吸道傳播所引起的化膿性腦膜炎，常在冬春季節(jié)引起發(fā)病與流行,患者以兒童為多見，現在成年人發(fā)病有增多趨勢。人受Nm感染后大多數表現為鼻咽部帶菌狀態(tài)，只有少數成為流腦患者。第2頁/共34頁正常人群中Nm帶菌率可達5～

30%。，帶菌者為流腦流行的重要傳染源。細菌經飛沫傳播，患者潛伏期1～

4天，其發(fā)展經過可分為三期：

1.首先侵入鼻咽腔，引起上呼吸道感染，有時局部有炎癥。

2.少數細菌侵入血流，造成單純菌血癥，可有突然發(fā)作的惡寒、發(fā)熱、惡心、嘔吐等，并可有出血性或紅斑性皮疹，或稱淤血點。

3.大量細菌侵入，由血液或淋巴到達腦脊髓膜，引起腦脊髓膜炎的癥狀與體征，如頭痛、嘔吐、頸項強直、發(fā)熱等一般腦膜炎癥狀。

第3頁/共34頁適宜的檢測樣品鼻咽拭子、血液、皮膚粘膜出血點擠出液、血清及腦脊液等。其中腦脊液、血液、皮膚粘膜出血點擠出液中檢出腦膜炎奈瑟氏菌可直接作為確診依據。第4頁/共34頁樣品采集與運送

第5頁/共34頁樣品采集（一）

腦脊液：無菌操作，吸出CSF3~5mL，立即放到無菌試管內離心(2000～

3000r/min，30min)，用滅菌過的毛細管吸取沉淀物直接接種到10％羊血巧克力色瓊脂上(CSF上清液部分供檢測Nm特異抗原，亦可將其置于－20℃待測)，5％二氧化碳環(huán)境37℃培養(yǎng)24～

72h，每日檢查細菌生長的情況，及時分離純培養(yǎng)物供鑒定。第6頁/共34頁樣品采集（二）

血液：采取病人急性期靜脈血液6mL，無菌操作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉湯三角瓶內注入4mL血液(余下的2mL血液同上離心后吸出血清，供檢測Nm特異抗原和抗體，亦可將其置于一20℃待測)，同上述條件培養(yǎng)24~72h，每日進行分離培養(yǎng)。第7頁/共34頁樣品采集（三）淤血點：選病人皮膚上的新鮮淤血點或淤斑，消毒后用針頭挑破，擠出組織液，用無菌棉簽蘸取先接種含雙抗的葡萄糖增菌肉湯管中增菌8~12h后分離培養(yǎng)或直接接種10％羊血巧克力色瓊脂；涂片，干后革蘭染色，直接鏡檢。第8頁/共34頁樣品采集（四）咽拭子：用長柄棉拭子采咽后壁兩側分泌物，立即接種卵黃雙抗培養(yǎng)基或巧克力雙抗平板，也可將咽拭子放入液體雙抗增菌管內，增菌8~12h后分離培養(yǎng)。第9頁/共34頁咽拭子接種第10頁/共34頁咽拭子接種第11頁/共34頁不合格咽拭子接種第12頁/共34頁不合格咽拭子接種第13頁/共34頁樣品的處理和運送

早期采集樣品：應盡可能采集病人用藥前的早期樣品，這可以明顯提高病原的檢出水平。及時處理樣品：應盡可能地做到床邊接種，若無可能則應在最短的時間內送到實驗室進行接種培養(yǎng)。保溫運送：應盡可能保持樣品處于20~36℃之間，切記不能低溫運送（檢測抗體的血清標本除外）。第14頁/共34頁流腦病原學檢查方法

第15頁/共34頁生長特性腦膜炎雙球菌為專性需氧菌，初次分離時需5~10%的二氧化碳環(huán)境才能生長，最適生長溫度為37℃。第16頁/共34頁菌落特征及菌體形態(tài)菌落：Nm接種于巧克力色瓊脂平皿上，5%CO2，37℃培養(yǎng)24小時后，其菌落直徑約1mm，表面突起、光滑、濕潤、圓整、略帶灰白色、半透明、不溶血、無色素。細菌形態(tài)：為革蘭氏陰性，呈卵圓形和腎形，0.8×0.6大小。常成對排列，鄰近兩邊扁平凹陷第17頁/共34頁菌落特征第18頁/共34頁菌落特征第19頁/共34頁腦脊液涂片

第20頁/共34頁生化特征分解葡萄糖和麥芽糖，產酸不產氣。不分離蔗糖、果糖和乳糖。過氧化酶和氧化酶陽性

第21頁/共34頁血清分群鑒定檢查從病人分離的疑似Nm時，先用多價Ⅰ、多價Ⅱ、多價Ⅲ抗血清檢測，如果陽性再用分群血清（A群、B群、C群、W135群抗血清等）檢測。不與鹽水發(fā)生凝集，與一種腦膜炎抗血清發(fā)生凝集反應，即為某一型的流腦菌。在鹽水中發(fā)生凝集反應，不能作為抗血清分群。第22頁/共34頁菌種保存

短期保存：保存腦膜炎雙球菌，用卵黃鹽水保存，可保存7天。2長期保存：最好方法是低溫冷凍或冷凍干燥。所有的細菌都可在-70℃冰箱中冷凍保存。將腦膜炎雙球菌接種巧克力平板中，放二氧化碳培養(yǎng)箱中35～

37℃孵育18～

20小時，收集細菌放到含1ml脫脂牛奶的2ml螺蓋冷凍瓶中。將菌苔在管壁研磨振蕩，使細菌分散在培養(yǎng)基中。-70℃低溫冰箱分類保存。第23頁/共34頁流腦血清學檢查方法（一）

玻片凝集試驗:應用玻片凝集試驗對Nm病原菌株或帶菌者菌株進行血清學分群。

Nm診斷血清：國產售品有多價Ⅰ（包含A、B、C、D群），多價Ⅱ[含1889（Y）、1890（H）、1892（29E）]，多價Ⅲ[含319（W135）、1916（X）、1486（I）、1811（K）群]及各群單價血清，共計14種。（括號內為國際編碼）第24頁/共34頁流腦血清學檢查方法（二）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：應用ELISA間接法測病人急性期和恢復期血清中抗A群流腦IgG的抗體水平。此方法也可以應用于健康者血清抗體的測定。若病人恢復期血清抗體效價較急性期呈現4或4倍以上升高有追溯診斷的意義。第25頁/共34頁流腦血清學檢查方法（三）殺菌力試驗：應用微量殺菌力試驗(TTC法)測定病人急性期和恢復期血清中對Nm的殺菌抗體水平。此方法也可用于健康人群的血清抗體測定。

第26頁/共34頁流腦其它檢查方法（一）膠乳凝集試驗應用膠乳凝集實驗測定病人CSF、急性期血清和尿中Nm群特異抗原，輔助流腦臨床診斷?？捎檬惺鄣哪X膜炎乳膠凝集試劑盒（如法國梅里埃公司的試劑盒）。方法：一滴乳膠試劑（30μl）加上一滴病人的腦脊液，涂勻，在2分鐘內出現明顯凝集者為陽性。第27頁/共34頁流腦其它檢查方法（二）

PCR檢測：應用PCR檢查病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特異片段，對流腦病人進行早期診斷。

第28頁/共34頁培養(yǎng)基制備巧克力色血液瓊脂：

成份：營養(yǎng)瓊脂（pH7.6）100ml

脫纖維血5~10ml

制法：將營養(yǎng)瓊脂溶解，以無菌手續(xù)加入羊血，搖勻。置水浴鍋內，維持在90℃20~30min。待培養(yǎng)基冷至50℃時才傾注平板。如做病人密切接觸者或健康人群帶菌調查時，則需加雙抗，每1000ml培養(yǎng)基加入多粘菌素4.2mg（或2.5萬單位），萬古霉素3.3mg。

第29頁/共34頁卵黃鹽水將新鮮雞蛋洗凈，在70%酒精中浸泡消毒1h后取出，用3%碘酒消毒蛋殼，以無菌操作于雞蛋的一端開一小孔，使蛋清全部流盡，蛋黃倒入置有玻璃珠的三個燒瓶中，打碎后，一份蛋黃加一份生理鹽水，再在搖珠瓶中振搖，使其混勻呈乳狀分裝試管，56℃加溫30min，置37℃作無菌試驗。（腦膜炎雙球菌保菌用）第30頁/共34頁增菌肉湯成份：新鮮牛肉湯100ml葡萄糖0.5g

配制：混合上述成份，調pH至7.4~7.6分裝試管，2ml/管或30ml/瓶，高壓滅菌10磅10分鐘，無菌檢驗合格后供增菌用。第31頁/共34頁診斷試劑1、診斷血清：中國CDC傳控所呼吸道細菌室流腦組（北京昌平流字五號）或中國藥品生物制品檢定所（天壇西里2號）。

2、巧克力平板：自制或市售。

3、多粘菌素或萬古霉素：北京陸橋技術有