2021年宏基因組測序在感染性疾病病原學(xué)診斷中的應(yīng)用(全文)

2021年宏基因組測序在感染性疾病病原學(xué)診斷中的應(yīng)用（全文）感染性疾病一直是世界范圍內(nèi)一類主要致死性疾?。?］。世界衛(wèi)生組織（WHO）監(jiān)測統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在2016年全球約5690萬例死亡患者中，有3種感染性疾?。ㄏ潞粑栏腥?、腹瀉性疾病、結(jié)核）位列前十大死因，造成的死亡數(shù)約占總死亡數(shù)的10%，其中下呼吸道感染造成約300萬例患者死亡，腹瀉性疾病造成約140萬例患者死亡，結(jié)核造成約130萬例患者死亡［2］。感染性疾病的病原體十分復(fù)雜，包括細(xì)菌、病毒、真菌及寄生蟲等，而在目前的臨床微生物檢測工作中，微生物實驗室對病原體的診斷主要還是依賴自19世紀(jì)開展的培養(yǎng)、染色鏡檢等傳統(tǒng)檢測方法，以及后續(xù)發(fā)展的核酸擴(kuò)增檢測伽PCR）、分子免疫學(xué)檢查（如ELISA）等檢測手段，存在著樣本處理過程復(fù)雜、花費(fèi)時間長、可檢測病原體種類少等缺點，導(dǎo)致感染性疾病的病原學(xué)診斷、病情評估及治療方案制定等存在困難［3］。目前仍有約60%的感染性疾病的病原體是診斷不明的［4］。由于宏基因組測序?qū)Σ≡瓕W(xué)診斷具有無偏移、全覆蓋、高效率等優(yōu)勢，越來越多的學(xué)者嘗試將其應(yīng)用于臨床病原學(xué)診斷之中。本文回顧了近些年宏基因組測序在感染性疾病病原學(xué)診斷中的臨床應(yīng)用進(jìn)展情況。1臨床宏基因組學(xué)（Clinicalmetagenomics,CMg）1.1CMg的^展史宏基因組的概念最早在1998年被學(xué)者提出，指在一份獨(dú)立的土壤標(biāo)本中，所有微生物的基因組信息的總和，包括那些無法培養(yǎng)的生物體的基因組信息［5］。后來，宏基因組的概念不僅僅局限于描述環(huán)境來源的標(biāo)本，還被逐漸用于描述臨床來源標(biāo)本中的生物遺傳信息特征。CMg指為獲取臨床相關(guān)的微生物信息而對臨床來源的標(biāo)本中所有的核酸序列進(jìn)行測序分析的一門學(xué)科［6］。宏基因組測序主要是通過以新一代測序（Next-generationsequencing，NGS）或稱二代測序為代表的高通量測序技術(shù)，對臨床來源的標(biāo)本進(jìn)行宏基因組學(xué)分析，以獲取病原體的物種分類、血清型、耐藥性及毒力等一系列生物信息（7］。以Sanger測序為代表的一代測序技術(shù)一般僅可獲取數(shù)百個堿基序列信息，由于其耗時且昂貴，正被后續(xù)發(fā)展的高通量測序所取代?，F(xiàn)有的高通量測序技術(shù)可讀取的核酸讀長范圍從數(shù)十堿基到數(shù)萬堿基不等，其中二代測序技術(shù)一般具備短讀長、高通量、準(zhǔn)確率較高且花費(fèi)較低等優(yōu)點，三代測序雖然可直接讀取較長核酸序列信息且速率更快，但是目前隨機(jī)錯誤率更高，花費(fèi)也更多［8］。通過評估臨床應(yīng)用中對檢測結(jié)果所要求的精確度、時間及花費(fèi)等諸多因素，可有條件地從中選擇合適的測序方式。由于宏基因組測序不依賴病原體培養(yǎng)結(jié)果且可以不對可疑病原體的標(biāo)志核酸序列進(jìn)行靶向擴(kuò)增，這使得檢測結(jié)果更具客觀性和全面性，且更迅捷，這是對傳統(tǒng)實驗室檢測手段的有效補(bǔ)充?！吨袊扇酸t(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南(2018年版)》［9］也指出CMg能明顯提高病原體診斷的敏感性，部分病原體檢測花費(fèi)的時間更短，尤其對罕見病原體的診斷具有優(yōu)勢，可審慎地應(yīng)用于臨床實踐之中。正是得益于測序技術(shù)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，CMg應(yīng)用于臨床病原體診斷正變得更加全面、廉價、高效及準(zhǔn)確［6,10］。1.2CMg的分^目前基于宏基因組測序的微生物分類檢測技術(shù)主要包括以下兩種靶巴向擴(kuò)增測序和鳥槍宏基因組測序［7］。1.2.1靶向擴(kuò)增測序靶向擴(kuò)增測序是指對目標(biāo)病原體的具有物種特異性的標(biāo)志核酸序列進(jìn)行測序分析以鑒別具體病原體種類，這要求操作者對目標(biāo)病原體的可能分類要有初步的概念，并且針對不同種類的病原體選擇不同的序列目標(biāo)，例如16srRNA對應(yīng)于細(xì)菌和古生菌，18srRNA對應(yīng)于真核生物，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internaltranscribedspacer，ITS)對應(yīng)于真菌等。靶向擴(kuò)增測序首先需要收集臨床檢測標(biāo)本，之后對標(biāo)本中的DNA進(jìn)行提取并純化，獲得包含微生物核酸以及人源核酸的混合物，再以微生物目標(biāo)基因序列為樣本靶向擴(kuò)增出包含對應(yīng)序列的DNA序列，然后將擴(kuò)增后的DNA序列碎片化后再行高通量測序［11］。靶向擴(kuò)增測序具備特異性高、標(biāo)本量需求低、實驗室操作相對簡單、花費(fèi)相對低等優(yōu)勢，且不受人源遺傳信息的影響，適用于除病毒感染外的病原體分類預(yù)估把握相對高、臨床標(biāo)本中病原體核酸含量低或者人源遺傳信息含量高的病例，但其無法呈現(xiàn)宏基因組中的全部基因組信息，對臨床病原體的檢測存在一定的偏倚性和局限性7］。1.2.2鳥槍宏基因組測序鳥槍宏基因組測序是指對樣本中所獲得全部核酸序列無偏倚地進(jìn)行測序分析，其主要流程同樣包括收集臨床檢測標(biāo)本以及核酸的提取和純化。由于標(biāo)本中可能含有RNA，如需同時評估該RNA對應(yīng)的病原體信息，需要將其轉(zhuǎn)變?yōu)閷?yīng)的cDNA。然后將含有病原體核酸、人源核酸以及可疑污染物的核酸混合物直接碎片化并行高通量測序，因而可以獲得更加全面而詳細(xì)的病原體遺傳信息，且無需針對可疑病原體進(jìn)行預(yù)先評估和特異性準(zhǔn)備［11］，尤其適用于懷疑病毒感染、病原體診斷困難及暴發(fā)感染等的病例［7］。但是鳥槍宏基因組測序結(jié)果中包含了人源核酸序列以及可疑污染物的核酸序列，需要生物信息學(xué)分析對其進(jìn)行更精確解讀，以利于正確的病原體判斷。宏基因組測序除具備病原體檢測無偏倚性的特點外，其相較于傳統(tǒng)檢測手段最大的優(yōu)勢是檢測時間更短。目前宏基因組測序明確病原體遺傳信息的時間一般不超過48h，平均時間約為24h，最快僅花費(fèi)9h即確診致病病原體［12］，明顯短于傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法所花費(fèi)的時間平均約3一5d)［ii］。更短的周轉(zhuǎn)時間意味著臨床醫(yī)師可更快地評估病原體并盡早實施適當(dāng)?shù)闹委煼桨?，這對減少廣譜抗菌藥物的使用及降低患者病死率都有著極大的益處。2宏基因組測序在感染性疾病病原診斷中的應(yīng)用目前已有不少應(yīng)用宏基因組測序成功對臨床感染性疾病患者進(jìn)行病原學(xué)診斷的研究報道［6,10］。研究所涉及的感染性疾病主要包括呼吸道感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、血流感染、骨關(guān)節(jié)感染、消化系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染以及眼內(nèi)感染等［6］，且涉及范圍和內(nèi)容正不斷延伸拓展。尤其在一些存在免疫缺陷的感染患者、傳統(tǒng)檢測手段反復(fù)檢測仍無法明確病原體及新型或罕見病原體感染的案例中，宏基因組測序正不斷顯示出其特有的優(yōu)越性［10,12,13,14。2.1在呼吸道感染病原診斷中的應(yīng)用呼吸道感染是感染性疾病中主要的致死原因之一［3］，僅僅依靠培養(yǎng)等傳統(tǒng)檢測手段使其病原體診斷存在諸多困難。有學(xué)者回顧性研究了2017年4至12月采集的511份臨床來源的呼吸道樣本，對其進(jìn)行宏基因組測序以檢測病原體類型并同步對比微生物實驗室培養(yǎng)，結(jié)果顯示宏基因組測序可將病原體診斷敏感度由35.2%提升至50.7%，且在檢測前已臨床應(yīng)用抗菌藥物的病例中提升尤為顯著［15］。病毒是呼吸道感染的主要病原體之一，但由于其種類多、變異快、實驗室無法直接培養(yǎng)等特點，目前臨床檢測手段仍相當(dāng)有限。早在2009年的一項研究中，日本的研究人員采集了流感流行期間不同患者的5份鼻咽分泌物標(biāo)本和3份排泄物標(biāo)本，應(yīng)用宏基因組測序技術(shù)成功在所有標(biāo)本中都檢測出了流感病毒或諾如病毒的核酸序列，其結(jié)果與同步進(jìn)行的RT-PCR驗證結(jié)果一致［16］。在近期的多項臨床研究中，相較多重PCR、呼吸道病毒檢測芯片等檢測方法，宏基因組測序?qū)粑啦《靖腥镜脑\斷有更高的檢出率，且能發(fā)現(xiàn)被遺漏未檢出的病毒，這主要得益于宏基因組測序的無偏倚性和高效性［17,18］。選擇優(yōu)質(zhì)的臨床檢測標(biāo)本及適當(dāng)?shù)母咄繙y序技術(shù)可以進(jìn)一步提高宏基因組測序診斷病原體的速率。肺泡灌洗液作為呼吸道感染患者一種優(yōu)質(zhì)的臨床檢測標(biāo)本類型，因為其中包含更高濃度的遺傳信息，使得其在宏基因組測序的應(yīng)用中具備更高的敏感度，尤其是對于病毒及真菌的檢測［19］。有學(xué)者報道了1例經(jīng)諸多常規(guī)檢測方法仍未明確病原體的重癥醫(yī)院獲得性肺炎病例，選取肺泡灌洗液作為檢測標(biāo)本，通過宏基因組測序后確證了其致病病原體為罕見的鼻病毒B91，隨后患者得到了及時且合理的治療最終好轉(zhuǎn)出院［14］。Pendleton等［12］在1例細(xì)菌性肺炎的病例中，選取肺泡灌洗液作為標(biāo)本，并應(yīng)用三代測序技術(shù)進(jìn)行宏基因組測序，僅花費(fèi)9h即確診了病原體為銅綠假單胞菌，而在同步進(jìn)行的實驗室培養(yǎng)在約23h后方才獲得陽性結(jié)果。盡管有學(xué)者提出該研究結(jié)果在實驗室操作流程規(guī)范性以及結(jié)果解讀等方面存在爭議，但宏基因組測序所具備的高效性顯示了其可進(jìn)行病原學(xué)實時檢測及診斷的臨床應(yīng)用潛力。例如，在作為重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)中最常見的醫(yī)院獲得性感染性疾病之一的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎，常常因為病原學(xué)診斷困難而影響診治，通過采集患者不同感染階段的多份痰標(biāo)本及排泄物標(biāo)本送檢宏基因組測序，同期對比實驗室培養(yǎng)可更詳盡地呈現(xiàn)病原體種類信息、含量變化以及耐藥基因分布，使得這些患者獲得更及時和有效的治療［20］。雖然理論上宏基因組測序可應(yīng)用于所有呼吸道感染的病例，但在免疫功能正常的肺炎患者中，采用更方便經(jīng)濟(jì)的傳統(tǒng)微生物檢測手段進(jìn)行病原體的初步診斷仍然更加適用。然而在不同的宿主環(huán)境中，個體呼吸道的微生物群落種類和豐度存在一定的差異，尤其是在不同免疫功能狀態(tài)的群體中。有學(xué)者利用二代測序技術(shù)比較發(fā)現(xiàn)了健康人群組、HIV陽性患者組以及肺移植受者組中真菌群落分布存在差異，并指出在臨床實踐中需有針對性地對測序結(jié)果進(jìn)行判讀［21］。這說明對特殊患者群體，尤其是免疫功能不全的患者，需要更審慎地對宏基因組測序的檢測結(jié)果進(jìn)行解讀。有研究發(fā)現(xiàn)，繼發(fā)呼吸道感染的骨髓移植受者可通過宏基因組測序成功診斷多種病毒的感染，即使是在細(xì)菌與病毒混合感染的病例之中也適用22］。此外，宏基因組測序不僅可以在肺移植受者合并呼吸道感染時做到與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法，如培養(yǎng)、多重特異性PCR、呼吸道病毒檢測芯片等，擁有一致的敏感性［23］，而且在傳統(tǒng)檢測手段無法確診病原體的免疫功能不全以及重癥患者中也可發(fā)現(xiàn)新的可疑病原體。

2.2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原診斷中的應(yīng)用中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原學(xué)診斷一向是一個臨床難題。有統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，僅腦炎患者中約63%的病例是病原體診斷不明的［4］。對于腦炎而言，明確其是自身免疫因素還是感染性疾病導(dǎo)致的炎癥，對于其后續(xù)的診治方案選擇具有重要意義，這更加彰顯出明確病原體的重要性［9］。宏基因組測序作為病原學(xué)診斷的一種強(qiáng)力工具，很早就被學(xué)者應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原體診斷之中。2014年，1例14歲伴免疫功能缺陷的男性患者病例報告中，臨床診斷為"中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染"，在經(jīng)受包括顱腦MRI、腦組織活檢在內(nèi)的多種臨床檢測手段后均未發(fā)現(xiàn)致病病原體，最后通過宏基因組測序成功在腦脊液中發(fā)現(xiàn)了鉤端螺旋體核酸序列進(jìn)而確診，并在針對病原體治療后好轉(zhuǎn)出院24］。隨著宏基因組測序的不斷發(fā)展，成功幫助中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染進(jìn)行病原學(xué)診斷的案例也越來越多。在2017年的1例病例報告中，臨床上應(yīng)用宏基因組測序技術(shù)，在排除了一系列傳統(tǒng)檢測手段獲得的可疑病原體信息的干擾之后，成功確診1例罹患神經(jīng)型布魯菌病病例［13］。另外在2018年的一項研究中，研究者在采集長期病原體診斷不明的慢性腦膜炎患者的腦脊液后通過宏基因組測序技術(shù)成功幫助全部7例患者確診病原體（包括2例寄生蟲感染，1例病毒感染以及4例真菌感染）［25］。除此之外，還有許多成功運(yùn)用宏基因組測序診斷罕見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病例，如豬帶絳蟲26］、戊肝病毒［27］、巴氏變形蟲［28］等病原體感染都被陸續(xù)報道，這說明宏基因組測序?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)感染診斷的臨床應(yīng)用有著光明的前景，尤其在傳統(tǒng)微生物檢測手段無法明確病原體的病例中。一篇關(guān)于宏基因組測序應(yīng)用于腦炎病原學(xué)診斷的Meta分析中，納入了25篇文獻(xiàn)，共44個病例。結(jié)果顯示，在28例病原體診斷不明的病例中，宏基因組測序均成功明確了病原體，其中甚至包含了5例罕見病原體感染以及5例之前從未在中樞神經(jīng)感染中報道的病原體［10］。2.3在血流感染病原體診斷中的應(yīng)用2.3在血流感染病原體診斷中的應(yīng)用hi血流感染是患者入住ICU的主要病因之一，其病情重，要求臨床醫(yī)師盡早明確病原體并及時開始適當(dāng)?shù)目垢腥局委熞愿纳祁A(yù)后。目前血培養(yǎng)依舊是血流感染病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，然而大約50%的病例血培養(yǎng)結(jié)果為陰性，從而導(dǎo)致了診治的延誤［29］。有學(xué)者嘗試使用宏基因組測序?qū)CU中血流感染患者進(jìn)行病原體診斷，結(jié)果顯示，其對比血培養(yǎng)能顯著提高診斷的敏感性［30］。尤其對于血培養(yǎng)陰性病例，如感染性心內(nèi)膜炎，宏基因組測序能有效幫助評估病原體信息以指導(dǎo)臨床診治［31］。宏基因組測序不僅適用于血培養(yǎng)陰性的病例，對于血培養(yǎng)報陽比較遲的病例也可進(jìn)一步提高診治及時性。有學(xué)者通過宏基因組測序成功在24h內(nèi)診斷了1例犬咬二氧化碳嗜纖維菌感染的病例，而作為一種診斷實驗室培養(yǎng)困難的苛養(yǎng)菌其血培養(yǎng)結(jié)果在約5d之后才可能有陽性結(jié)果［32］。此外，通過血流感染的病原學(xué)檢測，也可為其他局部感染病例提供有效的病原指導(dǎo)信息。例如，肺移植患者由于長期處于免疫功能抑制狀態(tài)而有著極高的感染風(fēng)險，而侵襲性操作檢查可能增加感染幾率，因此通過對受測者的血漿樣本中的非人源游離DNA測序來監(jiān)測是否感染有著獨(dú)到的優(yōu)勢［33］。此外，雖然侵襲性真菌病的明確診斷主要依賴于活檢組織微生物學(xué)檢查，但也有研究證實，通過對患者血漿樣本的病原體DNA進(jìn)行二代測序也可有效進(jìn)行病原學(xué)診斷，尤其適用于深部組織活檢困難的病例［34］。如今越來越多的學(xué)者開始采用宏基因組測序?qū)ρ鞲腥净颊哌M(jìn)行病原學(xué)診斷，或作為血培養(yǎng)等常規(guī)檢測方法的補(bǔ)充檢測手段。通過宏基因組測序發(fā)現(xiàn)在健康人群血液標(biāo)本中也可檢測出厭氧菌等一些微生物的遺傳信息，其微生物種群特點與血流感染患者存在明顯差異，這說明臨床醫(yī)師對于檢測結(jié)果的解讀需要結(jié)合更詳盡的臨床信息［35］。血流感染病原診斷至今，宏基因組測序已在血流感染病原診斷中成功診斷10多種病毒和細(xì)菌，包括皰疹病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、鏈球菌、嗜血桿菌、葡萄球菌和腸桿菌等，以及其他少見病原體。尤其在血培養(yǎng)陰性的病例中，宏基因組測序常能發(fā)現(xiàn)診斷困難的病原體，為患者的臨床診治提供依據(jù)，是傳統(tǒng)檢測方法的有效補(bǔ)充。2.4在其他部位感染病原診斷中的應(yīng)用目前還有很多感染性疾病嘗試應(yīng)用宏基因組測序進(jìn)行臨床病原學(xué)診斷。有學(xué)者對24例骨關(guān)節(jié)感染病例的病原學(xué)診斷進(jìn)行驗證研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)宏基因組測序與微生物實驗室培養(yǎng)結(jié)果有著高度一致性，且在多重病原體感染的病例中宏基因組測序有著更高的敏感性［36］。另外對于人工關(guān)節(jié)感染病例，宏基因組測序同樣顯示了強(qiáng)大的病原學(xué)診斷能力，有學(xué)者通過進(jìn)一步優(yōu)化選擇測序技術(shù)，提高了檢測速率，使得臨床醫(yī)師可以更快獲得病原體信息［37］。在消化系統(tǒng)感染病例中，有研究對比使用PCR、定量PCR、靶向擴(kuò)增測序以及鳥槍宏基因組測序?qū)Ω篂a患者的排泄物進(jìn)行病原體檢測，其中靶向擴(kuò)增測序和鳥槍宏基因組測序均顯示出更高的診斷敏感性，且鳥槍宏基因組在發(fā)現(xiàn)了主要致病菌(艱難梭菌)以外，也檢測出數(shù)種可能致病的病毒，體現(xiàn)了鳥槍宏基因組更強(qiáng)的病原體檢測能力［38］。在泌尿系統(tǒng)感染病例中，運(yùn)用宏基因組測序成功診斷了復(fù)雜性尿路感染的病原體，并且顯示出相較于培養(yǎng)更快的診斷速率［39］。另外也有學(xué)者將宏基因組測序應(yīng)用于眼內(nèi)感染的病原學(xué)診斷結(jié)果顯示宏基因組測序不僅與PCR檢測陽性的標(biāo)本的檢測結(jié)果高度一致，而且在PCR檢測陰性的標(biāo)本中，宏基因組測序檢出了未曾預(yù)測到的致病病原體，進(jìn)而使患者獲得了更好的病情評估和診治［40］。3宏基因組測序的問題和瓶頸目前宏基因組測序正走出實驗室，并在臨床病原學(xué)診斷的應(yīng)用中取得越來越多的成果，已被認(rèn)為是臨床病原學(xué)診斷的重要手段之一。但是，將宏基因組測序推廣應(yīng)用到常規(guī)臨床實驗室檢測工作中，目前仍有許多問題需要解決，包括：(1)檢測流程的標(biāo)準(zhǔn)化，例如標(biāo)本的采集和儲存、核酸序列的提取與污染物的處理、核酸序列數(shù)據(jù)庫的合理選取、高效且準(zhǔn)確的生物信息學(xué)分析等；(2)測序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，例如更低的硬件設(shè)施配置要求、更短的周轉(zhuǎn)時間、更高的檢測靈敏度等；(3)更低的檢測費(fèi)用；還有人工操作的培訓(xùn)、結(jié)果解讀的指導(dǎo)等［6,7,11,41］。目前宏基因組測序應(yīng)用的主要制約瓶頸是如何將測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確地