空腸彎曲桿菌分子生物學(xué)鑒定課件

空腸彎曲桿菌分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展一、空腸彎曲桿菌簡(jiǎn)介二、DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法三、DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)空腸彎曲桿菌四、研究意義五、前人研究進(jìn)展六、擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題一、空腸彎曲桿菌簡(jiǎn)介空腸彎曲桿菌（Campylobacterjejuni,C.jejuni)作為一種食源性人畜共患病的病原體，越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外高度重視。近年來(lái)，空腸彎曲桿菌感染率在世界各地普遍呈上升趨勢(shì)?？漳c彎曲桿菌為多形性，呈弧形，螺旋形、海鷗展翅形或S形。革蘭氏染色陰性?？漳c彎曲桿菌在外環(huán)境下的存活力取決于溫度，4℃時(shí)在水、糞便、尿、牛奶中可存活幾周，25℃時(shí)只能存活幾天或更短的時(shí)間。對(duì)熱敏感，58℃經(jīng)過(guò)5分鐘即可殺滅，另外陽(yáng)光直射及消毒劑也有很好的殺滅效果?？漳c彎曲桿菌為微需氧菌，在大氣或厭氧的環(huán)境中不能生長(zhǎng)。空腸彎曲桿菌作為共生菌大量存在于各種野生或家養(yǎng)動(dòng)物的腸道內(nèi)，與人體感染較為密切的主要為家畜和家禽，家禽已從雞、鴨、鵝、火雞等家禽的糞便、膽汁、泄殖腔內(nèi)容物中分離到該菌，感染率高，帶菌期長(zhǎng)，可長(zhǎng)達(dá)18個(gè)月。分子生物學(xué)檢測(cè)方法常規(guī)生化檢測(cè)方法血清學(xué)方法PCR方法（定性PCR方法熒光定量PCR方法）環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法二、DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)，是分子生物學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)新概念，它可以在恒溫（60～65℃）條件下，30～60min內(nèi)將只有幾個(gè)拷貝的靶核酸擴(kuò)增到10⒐水平該方法的一大特色是，可以通過(guò)反應(yīng)副產(chǎn)物——白色焦磷酸鎂沉淀的產(chǎn)生與否判斷靶基因的存在。LAMP方法已具有成功應(yīng)用的現(xiàn)實(shí)性，為快速基因的檢測(cè)提供了一種新的技術(shù)途徑，比PCR方法更具推廣性，可望作為常規(guī)檢測(cè)的工具。2000年，Notomi等開發(fā)出一種新的DNA環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,LAMP）。LAMP方法利用Bst大片段DNA聚合酶和根據(jù)不同靶序列設(shè)計(jì)的兩對(duì)特殊的內(nèi)引物（FIP由F1C和F2組成；BIP由BIC和B2組成）、外引物（F3和B3），特異地識(shí)別靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域。與此同時(shí)，BIP引物與被擠掉的這條單鏈雜交結(jié)合，形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開，接著，B3引物在BIP外側(cè)進(jìn)行堿基配對(duì)，在聚合酶的作用下形成新的互補(bǔ)鏈。被置換的單鏈DNA兩端均存在互補(bǔ)序列，從而發(fā)生自我堿基配對(duì)，形成類似啞鈴狀的DNA結(jié)構(gòu)。LAMP反應(yīng)以此DNA結(jié)構(gòu)為起始結(jié)構(gòu)，進(jìn)行再循環(huán)和延伸，靶DNA序列大量交替重復(fù)產(chǎn)生，形成的擴(kuò)增產(chǎn)物是有許多環(huán)的花椰菜形狀的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA，數(shù)量級(jí)可達(dá)10⒐DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)原理示意圖三、DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)空腸彎曲桿菌擬建立一種DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法來(lái)檢測(cè)空腸彎曲桿菌與PCR擴(kuò)增方法類似，根據(jù)反應(yīng)的副產(chǎn)物是白色焦磷酸鎂沉淀，可肉眼觀察，來(lái)鑒定反應(yīng)是否進(jìn)行。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物可以像PCR反應(yīng)一樣利用凝膠電泳并結(jié)合成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。利用LAMP方法檢測(cè)空腸彎曲桿菌，不僅可以對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行定性，而且還可以通過(guò)利用焦磷酸鎂沉淀的產(chǎn)生量與DNA的生成量之間的線性關(guān)系，對(duì)反應(yīng)的DNA進(jìn)行定量。四、研究意義預(yù)防和控制空腸彎曲桿菌病在我國(guó)的流行，不但具有重要的經(jīng)濟(jì)意義，更重要的是將在我國(guó)社會(huì)發(fā)展中起重要作用，具有重大的社會(huì)意義。只有對(duì)空腸彎曲桿菌流行分布狀況進(jìn)行全面系統(tǒng)地調(diào)查研究，搞清其感染率和發(fā)病率，掌握其耐藥譜，才能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)其流行趨勢(shì)。五、前人研究進(jìn)展一般對(duì)空腸彎曲桿菌的檢測(cè)大多采用PCR方法。利用DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)了如金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀桿菌、李斯特菌等，前人均有文獻(xiàn)報(bào)道。王福厚等人用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP）檢測(cè)沙門氏菌的研究表明，LAMP方法特異性好，最佳反應(yīng)溫度為63℃，沙門氏菌的檢測(cè)靈敏度為7～8cfu/mL。LAMP方法檢測(cè)沙門氏菌特異性強(qiáng)、靈敏度高、時(shí)間短且操作簡(jiǎn)便，有望成為快速檢測(cè)沙門氏菌的新方法。李永剛等人用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)檢測(cè)金黃色葡萄球菌的研究表明：LAMP方法特異性好，最佳反應(yīng)溫度為61℃，靈敏度高，金黃色葡萄