生物化學(xué)-核酸化學(xué)課件

核酸化學(xué)核酸與蛋白質(zhì)是最重要的生物大分子。核酸有兩類：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）和核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）。核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。第一節(jié)

核酸概述一、核酸的研究發(fā)現(xiàn)史

1868年，F(xiàn).Miescher從細(xì)胞核中分離得到一種富含磷的酸性物質(zhì)，即現(xiàn)在被稱為脫氧核糖核蛋白的物質(zhì)。

1889年，Altman等從酵母和動(dòng)物的細(xì)胞核中制備了不含蛋白質(zhì)的核酸，首次使用“核酸”一詞命名。98％細(xì)胞核內(nèi)（染色體中）真核細(xì)胞線粒體核外葉綠體DNA擬核原核細(xì)胞核外：質(zhì)粒（plasmid）病毒：DNA病毒二、核酸的種類和分布

核酸按其所含糖的不同分為兩大類：脫氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid（DNA）核糖核酸RibonucleicAcid（RNA）RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，少量存在于細(xì)胞核中；

轉(zhuǎn)移RNA（transferRNA,tRNA）

占細(xì)胞總RNA的10～15％;

核糖體RNA（ribosomeRNA,rRNA）

占細(xì)胞總RNA的80％;

信使RNA（messengerRNA,mRNA）占細(xì)胞總RNA的5％;

其它具特殊功能的RNA;RNA病毒;植物病毒基因組大多是RNA三、核酸的生物學(xué)功能

DNA是主要的遺傳物質(zhì)，是遺傳信息的載體、負(fù)責(zé)遺傳信息的儲(chǔ)存與發(fā)布，并通過復(fù)制將遺傳信息傳給子代。RNA功能的多樣性：1、參與蛋白質(zhì)的生物合成2、RNA的轉(zhuǎn)錄后加工與修飾3、參與基因表達(dá)與細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)4、生物催化作用5、遺傳信息的加工與進(jìn)化第二節(jié)核酸的結(jié)構(gòu)元素組成：CHONP

核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)磷酸(phosphoricacid)核苷(nucleoside)戊糖(pentose)堿基(base)核酸由核苷酸組成，核苷酸又由堿基、戊糖與磷酸組成；二、堿基1.嘌呤堿123456978腺嘌呤AdenineA鳥嘌呤guanineG嘌呤兩類核酸中的嘌呤堿基完全相同；2.嘧啶堿123456尿嘧啶uracilU胞嘧啶cytosineC胸腺嘧啶thymineT嘧啶胞嘧啶為兩類核酸所共有，胸腺嘧啶只存在于DNA中，尿嘧啶只存在于RNA中；三、核苷（nucleoside）核苷：戊糖+堿基

糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵，核酸分子中為β－糖苷鍵。1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)為與堿基分子中的原子標(biāo)號(hào)相區(qū)別，糖的碳原子編號(hào)加上’。假尿嘧啶核苷（ψ）二氫尿嘧啶核苷等；5OHAdenosineGuanosineCytidineUridine常見核苷：稀有核苷：四、核苷酸（nucleotide）

核苷酸：核苷中的戊糖羥基被磷酸酯化

核苷+磷酸

戊糖+堿基+磷酸HHHHHHHHH2.環(huán)化磷酸化3‘，5’-環(huán)腺苷酸（cAMP）3‘，5’-環(huán)鳥苷酸（

cGMP）3.肌苷酸及鳥苷酸(強(qiáng)力味精)4.輔酶NAD、NADP、FMNIMP

GMP六、多聚核苷酸（核酸）多聚核苷酸是通過一個(gè)核苷酸的C3’-OH與另一分子核苷酸的5’-磷酸基形成3’,5’-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。5’5’3’3’5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3′-羥基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個(gè)多聚核苷酸鏈時(shí)，必須注明它的方向是5′→3′或是3′→5′。多聚核苷酸的表示方式DNARNA5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH′或5′ACGTGCGT3′5′ACGUAUGU3′

ACGTGCGTACGUAUGUT5’3’OHU5’3’OHOHOHOHOH第三節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)一、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)脫氧核苷酸的排列順序；可用堿基排列順序表示連接鍵：磷酸與戊糖順序相連形成主鏈骨架堿基形成側(cè)鏈多核苷酸鏈的方向性；DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。二、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的雙螺旋模型1953年，J.Watson和F.Crick在前人研究工作的基礎(chǔ)上，提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。DNA雙螺旋構(gòu)象的多態(tài)性除B型結(jié)構(gòu)外，還有：A型結(jié)構(gòu)堿基平面傾斜20o，螺旋變粗變短，螺距2～3nm。Z型結(jié)構(gòu)左手螺旋，只有小溝穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的力①堿基堆積力形成疏水環(huán)境（主要因素）。②堿基配對(duì)的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。③磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，減少雙鏈間的靜電斥力④堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。

二、DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)細(xì)胞中，由于DNA與其他分子的相互作用，使雙螺旋進(jìn)一步扭曲和折疊形成的構(gòu)象超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式，有正超螺旋和負(fù)超螺旋之分；天然環(huán)狀DNA一般都以負(fù)超螺旋構(gòu)象存在；負(fù)超螺旋正超螺旋第四節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)與功能一、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)堿基組成A、G、C、U（A＝U/G≡C）稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解多為單鏈結(jié)構(gòu)，可發(fā)生分子自身回旋，互補(bǔ)堿基區(qū)形成局部螺旋結(jié)構(gòu)，不能配對(duì)堿基區(qū)形成突環(huán)；分子較小(相對(duì)于DNA而言)分類mRNAtRNA

rRNA其他具特殊功能的RNA少數(shù)RNA病毒二、tRNA三葉草形二級(jí)結(jié)構(gòu)模型；堿基配對(duì)構(gòu)成雙螺旋區(qū)叫臂，不配對(duì)部分叫環(huán)，tRNA一般具四臂四環(huán)結(jié)構(gòu)；氨基酸臂二氫尿嘧啶環(huán)反密碼環(huán)額外環(huán)

TψC環(huán)（假尿嘧啶環(huán)）堿基組成中含有較多的稀有核苷酸；倒L形的三級(jí)結(jié)構(gòu)tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)tRNA的功能：●轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸●識(shí)別密碼子●參與翻譯起始●參與DNA的反轉(zhuǎn)錄●參與基因表達(dá)調(diào)控三、rRNA占RNA總量的80％，是構(gòu)成核糖體的骨架；原核生物真核生物核糖體rRNA核糖體rRNA30s70s50s16s5s、23s40s80s50s18s5s、5.8s、28srRNA的功能：●組成核糖體●催化肽鍵合成●參與tRNA與mRNA的結(jié)合大腸桿菌5SrRNA的結(jié)構(gòu)四、mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板，占細(xì)胞總RNA的3％～5％；真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)有明顯特征，3‘-末端有一段長達(dá)200個(gè)核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，稱為“尾結(jié)構(gòu)”，5’-末端有一個(gè)甲基化的鳥苷酸，稱為“帽結(jié)構(gòu)”。甲基鳥苷5’，5’-三磷酸尾結(jié)構(gòu)：

●

轉(zhuǎn)錄后由poly(A)聚合酶催化加尾●PolyA是mRNA由核進(jìn)入胞質(zhì)所必需的形式。●polyA與mRNA半壽期有關(guān)，PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。

●由甲基化酶催化形成；●可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA；●可為核糖體提供識(shí)別位點(diǎn)，使mRNA很快與核糖體結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成；帽結(jié)構(gòu)：第五節(jié)核酸的性質(zhì)一、一般的理化性質(zhì)兩性解離/一般呈酸性（在中性溶液中帶負(fù)電荷），DNA的pI為4～4.5，RNA的pI為2～2.5。提純的DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末，微溶于水，不溶于有機(jī)溶劑；能被乙醇或異丙醇沉淀。DNA分子由于直徑小而長度大，溶液粘度高；RNA分子粘度較??；核酸變性后粘度降低。室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解；核酸分子在緩沖液中帶有電荷，可利用電泳進(jìn)行分離；二、核酸的紫外吸收特性嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，核酸（包括堿基、核苷、核苷酸）具有獨(dú)特的紫外線吸收（240－290nm強(qiáng)吸收）光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰以A260/A280進(jìn)行定性、定量DNA的減色效應(yīng)DNA和RNA溶液中加入溴乙錠（EB），在紫外光下發(fā)出紅橙色熒光；三、核酸的變性、復(fù)性與分子雜交1.變性穩(wěn)定核酸雙螺旋次級(jí)鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。變性表征生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應(yīng)）變性因素

pH（>11.3或<5.0）變性劑（脲、甲酰胺、甲醛）低離子強(qiáng)度加熱DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。通常將紫外吸收達(dá)最大量（完全變性）一半（雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半）時(shí)的溫度稱熔點(diǎn)或熔解溫度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之間。DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關(guān)。G和C的含量高，Tm值高。測(cè)定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通過經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.442.熱變性和Tm3.核酸的復(fù)性變性核酸的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。變性的DNA緩慢冷卻時(shí)可復(fù)性，因此又稱為“退火”。

復(fù)性影響因素片段濃度/片段大小/片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）/溶液離子強(qiáng)度4.分子雜交DNA單鏈與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNA單鏈或RNA鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。Southern印跡法（Southernbolting）Northern印跡法（Northernbolting）Western