生物技術植物體細胞雜交技術

生物技術植物體細胞雜交技術第1頁/共45頁植物體細胞雜交的意義

有性雜交是植物遺傳改良的一種傳統(tǒng)手段。作用空間：主要限于種內的品種之間。

種及種以上分類單位之間的雜交，例如種間或屬間雜交，則常常遭遇有性不親和性障礙。第2頁/共45頁

在無性繁殖植物和性不育植物中，如在馬鈴薯、甘薯、木薯、甘蔗和香蕉中，更是難以通過有性雜交進行遺傳改良。因此，建立在原生質體全能性基礎上的體細胞雜交和胞質雜交技術，對于植物的遺傳改良具有重要的意義。第3頁/共45頁體細胞雜交（somatichybridization):

在離體條件下通過兩個親本體細胞原生質體的融合以及隨后將融合產物培養(yǎng)成雜種植株的過程。

1972年，Carlson首次獲得粉藍煙草和郎氏煙草的細胞雜種，這也是第一個植物體細胞雜種。

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1978年梅爾徹斯(Melchers)等首次獲得了番茄和馬鈴薯的屬間體細胞雜種——“Potamato”。

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第6頁/共45頁去掉細胞壁原生質體融合第7頁/共45頁

白菜—甘藍第8頁/共45頁

體細胞雜交步驟：1原生質體的制備2原生質體的融合3雜種細胞選擇4雜種細胞培養(yǎng)5由愈傷組織再生植株6雜種植株的鑒定第9頁/共45頁雜交的兩個細胞用纖維素酶、果膠酶處理細胞壁原生質體Ａ、Ｂ經離心、振動、電刺激用聚二乙醇（ＰＥＧ）誘導融合后的原生質體再生細胞壁雜種細胞脫分化細胞分裂愈傷組織雜種植株再分化（植物體細胞融合完成的標志）植物細胞融合植物組織培養(yǎng)第10頁/共45頁2原生質體融合2.1自發(fā)融合2.2誘發(fā)融合2.2.1NaNO3處理2.2.2高PH-高濃度鈣離子處理2.2.3PEG（聚乙二醇）處理2.2.4電融合第11頁/共45頁2原生質體融合2.1自發(fā)融合在酶解細胞壁的過程中，有些相鄰的原生質體能彼此融合形成同核體(homokaryon)，每個同核體包含2～40個核。

形成的原因：由不同細胞間胞間連絲的擴展和粘連造成的。

減少自發(fā)融合的措施：在用酶液處理之前，使細胞受到強烈的質壁分離藥物的作用，切斷胞間連絲。

第12頁/共45頁2原生質體融合

2.2誘發(fā)融合

2.2.1NaNO3處理

1909年，Kuster在一個發(fā)生了質壁分離的表皮細胞中，低滲NaNO3溶液可以引起2個亞原生質體的融合。缺點：異核體(heterokaryon)形成頻率不高。

第13頁/共45頁2原生質體融合2.2.2高PH-高濃度鈣離子處理

1973年，Keller和Melchers，用強堿性(PH10.5)的高濃度鈣離子（50mmol.L-1)溶液在37℃下處理約30min，兩個品系的煙草葉肉原生質體很容易融合。但對于有些原生質體系統(tǒng)，這樣高的PH值是有毒的。

第14頁/共45頁2原生質體融合2.2.3PEG(聚乙二醇)處理

PEG的作用機理：Kao等認為，由于PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質體之間形成分子橋，其結果是使原生質體發(fā)生粘連進而促使原生質體的融合。另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使原生質體的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。第15頁/共45頁2原生質體融合2.2.3PEG(聚乙二醇)處理

PEG作為融合劑的優(yōu)點:①異核體形成的頻率高，可重復性強，對大多數細胞低毒；②形成雙核異核體的頻率高。第16頁/共45頁2原生質體融合2.2.3PEG(聚乙二醇)處理據Burgess和Flenming（1974年）報道：在37℃下用高鈣離子的強堿性溶液處理時，產生的聚集體很大，每個包含很大原生質體。以PEG為融合劑時，多數聚集體包含2～3個原生質體。第17頁/共45頁2原生質體融合2.2.3PEG

(聚乙二醇)處理融合基本過程

第18頁/共45頁2原生質體融合2.2.3PEG(聚乙二醇)處理注意事項：①PEG的分子量（MW1500～6000）

②酶溶液濃度③原生質體來源④PEG的稀釋逐步進行⑤在PEG溶液中，加入鈣離子可以提高融合效率）

第19頁/共45頁2原生質體融合2.2.3PEG(聚乙二醇)處理⑥高溫（35～37℃）⑦4%～5%（V/V）的原生質體懸浮液⑧所用酶種類和濃度，一般用崩潰酶。⑨材料預培養(yǎng)⑩融合地點（在離心管中，在小液滴中）⑾在PEG溶液中的保溫時間太長會降低異核體形成頻率。第20頁/共45頁2原生質體融合2.2.4電融合將一定密度的原生質體懸浮液置于一個融合小室中，小室兩端有電極，在不均勻的交變電場的作用下，原生質體彼此靠近，在兩個電極間排列成串珠狀。這時，如果有足夠強度的電脈沖，就可以使質膜發(fā)生可逆性電擊穿，從而導致融合。第21頁/共45頁兩個電極間串珠狀原生質體第22頁/共45頁第23頁/共45頁

細胞電融合儀第24頁/共45頁2.3融合產物的細胞學

在膜融合以后的數小時內，2個細胞的細胞質混在一起，形成一個雙核異核體。在雙親親緣關系較近的異核體中，兩個核有可能同步進行第一次有絲分裂，而且在這個過程中，二者的染色體被一個共同的紡錘體所牽引，在有絲分裂末期形成兩個雜種子細胞。最終分化出體細胞雜種，其核內具有雙親的染色體組。第25頁/共45頁2.3融合產物的細胞學

在雙親親緣關系比較遠的雜種細胞中，兩個來源不同的染色體組常常不能完全結合在一起。在動物體細胞雜種細胞系中，已知雙親之一的染色體會逐漸消除，在植物中也看到這種現象。第26頁/共45頁3雜種細胞的選擇系統(tǒng)3.1根據物理特性選擇3.2突變互補選擇3.3根據生長和再生能力的差別選擇第27頁/共45頁3.1根據物理特性選擇3.1.1根據可見標志選擇

主要用于非綠色原生質體與含有葉綠體的原生質體的融合。（半綠半白）3.1.2根據熒光標記選擇

將2種原生質體群體分別用不同的熒光染料標記，然后通過熒光顯微鏡鑒別異核體。3.1.3低密度植板選擇

對細胞進行追蹤選擇。

第28頁/共45頁3.2突變互補選擇3.2.1隱性突變互補選擇3.2.2顯性抗性互補選擇3.2.3隱性突變與野生型互補選擇3.2.4顯-隱性雙突變體選擇

第29頁/共45頁3.3根據生長和再生能力的差別選擇

3.3.1根據愈傷組織生長差別選擇3.3.2植株再生能力的差別選擇3.3.3根據生長和分化對培養(yǎng)基要求的差別選擇第30頁/共45頁3.3根據生長和再生能力的差別選擇

3.3.1根據愈傷組織生長差別選擇在曼陀羅和煙草種間體細胞雜交以及在小麥和某些其他禾谷類植物屬間體細胞雜交中，發(fā)現雜種愈傷組織表現生長優(yōu)勢現象，因此融合處理后只要挑選生長快、長的最大的愈傷組織，就會從中分化出體細胞雜種。

第31頁/共45頁3.3根據生長和再生能力的差別選擇

3.3.2植株再生能力的差別選擇不同來源的原生質體分化再生植株的能力不同。在體細胞雜交中，只要有一個親本的原生質體能夠再生植株，融合產生的雜種細胞就能再生植株。

第32頁/共45頁3.3根據生長和再生能力的差別選擇

3.3.3根據生長和分化對培養(yǎng)基要求的差別選擇不同來源的原生質體對培養(yǎng)基成分和激素的要求不同。設計的培養(yǎng)基只有雜種細胞能夠生長。第33頁/共45頁4胞質雜交和胞質雜種

有性雜交，細胞質基因組來源于母本。體細胞雜交，雜種有兩個親本的細胞質基因組。胞質雜種(cybrid):

兩種來源不同的核外遺傳成分（細胞器）與一個特定的核基因組結合在一起。核質雜種(nucleo-cytoplasmichybrid):

一個親本的細胞核與另一個親本的細胞質基因組結合。

第34頁/共45頁4胞質雜交和胞質雜種獲得胞質雜種的方法：常先把異種胞質供體物種原生質體的核滅活，然后再將它與異種胞質受體物種的原生質體融合。⑴通過射線輻照滅活胞質供體細胞核⑵胞質體和原生質體的融合

第35頁/共45頁4胞質雜交和胞質雜種⑴通過射線輻照滅活胞質供體細胞核阻止沒融合的胞質供體細胞的分裂，細胞核部分或完全失活。阻止沒融合的受體細胞的分裂⑵胞質體和原生質體的融合利用細胞質供體細胞的去核原生質體與受體親本的完整原生質體融合。

第36頁/共45頁5體細胞雜種和胞質雜種的鑒定5.1形態(tài)和育性鑒定5.2細胞學和分子細胞學鑒定5.3生化鑒定5.4分子生物學鑒定第37頁/共45頁5體細胞雜種和胞質雜種的鑒定5.1形態(tài)和育性鑒定株型、葉形、花形，莖、葉茸毛的有無或多或少有雙親的特點育性取決于雙親親緣關系的遠近，雜種或是育性很低，或是完全不育。

第38頁/共45頁5體細胞雜種和胞質雜種的鑒定5.2細胞學和分子細胞學鑒定通過確定雜種染色體數和染色體形態(tài)第39頁/共45頁5體細胞雜種和胞質雜種的鑒定5.3生化鑒定同工酶譜分析法：將體細胞雜種的同工酶譜與其雙親的酶譜比較：雜種植株的酶譜可能是雙親酶譜帶的總和可能只出現雙親的部分酶帶或缺少雙親的某些酶譜而出現新的譜帶。

第40頁/共45頁5體細胞雜種和胞質雜種的鑒定5.4分子生物學鑒定

RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，擴增片段長度多態(tài)性)

SRAP(sequence-relatedamplifiedpolymorphism,序列相關擴增多態(tài)性)

SSR（Simplesequencerepeat，簡單序列重復）第41頁/共45頁6體細胞雜種在農業(yè)生產上的應用6.1對無性繁殖植物或性不育植物進行遺傳重組對2個不能進行有性繁殖的物種之間實現遺傳重組，體細胞融合目前看來是唯一途徑。性不育植物（單倍體、三倍體和非整倍體），融合后產生可育的二倍體或多倍體。第42頁/共