氨基酸自動(dòng)分析儀課件

第三十八章

氨基酸自動(dòng)分析儀概述實(shí)質(zhì)：高效液相色譜儀填料：強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹脂檢測(cè)器：可見或熒光分光光度計(jì)選擇性好、準(zhǔn)確度高分析速度快，靈敏度高概述20世紀(jì)40年代，開始探求色譜法分析氨基酸；提高洗脫流速、改良柱直徑、填料粒度，提高分析速度；20世紀(jì)80年代，鍵合反相分配色譜、柱前衍生技術(shù)的發(fā)展；目前，配合微機(jī)控制程序和處理數(shù)據(jù)，成為氨基酸最準(zhǔn)確可靠的分離測(cè)試方法。第一節(jié)基本原理先將氨基酸混合物在離子交換樹脂柱上進(jìn)行分離，然后按照分離后的氨基酸衍生。根據(jù)衍生產(chǎn)物的特性，選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器檢測(cè)并進(jìn)行定性與定量分析。1.1離子交換樹脂1.填料：磺酸型強(qiáng)酸陽(yáng)離子交換樹脂2.苯乙烯為主體；3.離子交換的活性基團(tuán)：磺酸根（連接在苯乙烯中乙烯基的對(duì)位上）；4.與二乙烯基苯交聯(lián)，形成不溶的高分子骨架，易吸水溶解。5.交聯(lián)劑所占比例決定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑大?。ò被幔?%~12%的交聯(lián)度）。6.Na+型（蛋白質(zhì)水解液中的氨基酸分析），Li+型（全部氨基酸的分析）7、考慮磺化程度、交聯(lián)劑純度和類型、粒度大小（5~10um）。1.2氨基酸在色譜柱中的分離XO3-Na++H3N+—CHRCOOHXSO3-H3N+—CHRCOOH+Na+PH減小PH增大PH小于氨基酸的等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸帶正電荷，可被磺酸基團(tuán)吸引，隨著PH升高或離子強(qiáng)度增大，氨基酸所帶正電荷減少，吸引力下降乃至消失而被洗脫下來。氨基酸的分離影響因素：離子交換樹脂的型號(hào)、粒度、交聯(lián)度；柱長(zhǎng)、直徑、柱溫；洗脫液的陽(yáng)離子類型、PH值、離子強(qiáng)度、洗脫梯度、流速及其中有機(jī)溶劑含量。1.2氨基酸在色譜柱中的分離1、3衍生及檢測(cè)多數(shù)氨基酸無生色基團(tuán)，在紫外可見光區(qū)無吸收（Phe、Trp、Lyr例外），需要將它們衍生，成為具有紫外、可見光吸收或能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)才可以檢測(cè)。常用的衍生方法：1、3衍生及檢測(cè)（1）茚三酮法多數(shù)氨基酸與水合茚三酮在弱酸條件下共熱，引起AA的氧化脫氨、脫羧反應(yīng)，水合茚三酮與氨合還原茚三酮反應(yīng)，生成紫色DYDA，最大吸收570nm（脯氨酸與羥脯氨酸例外，生成黃色化合物，最大吸收440nm）。最后根據(jù)吸光度與峰面積的關(guān)系定性定量分析。（2）鄰苯二甲醛（OPA）法1、3衍生及檢測(cè)AA分離后，可與鄰苯二甲醛混合，在常溫、乙硫醇或?-巰基乙醇存在下生成一種強(qiáng)熒光物質(zhì)。該衍生物在激發(fā)波長(zhǎng)340nm、吸收波長(zhǎng)455nm，可用熒光光度計(jì)檢測(cè)其發(fā)射的熒光。此外，脯氨酸與羥脯氨酸需要在氧化劑（NaClO）作用下，開環(huán)變?yōu)橐患?jí)胺，然后與OPA反應(yīng)。第二節(jié)氨基酸分析儀的結(jié)構(gòu)性能2、1結(jié)構(gòu)與流程見圖38-7（p181）洗脫裝置色譜柱（控溫）混合室反應(yīng)器檢測(cè)器工作站衍生液第二節(jié)氨基酸分析儀的結(jié)構(gòu)性能（2）進(jìn)樣分離系統(tǒng)組成：進(jìn)樣器、色譜柱AA最佳分離溫度：30~70度，需恒溫，一般柱溫升高，出峰時(shí)間縮短。（3）檢測(cè)系統(tǒng)第二節(jié)氨基酸分析儀的結(jié)構(gòu)性能取決于AA衍生的方式:茚三酮法，柱后衍生。茚三酮與分離后的AA混合并在100左右的水浴中反應(yīng)15min，最后由紫外檢測(cè)儀檢測(cè)。OPA法，分離柱流出液與NaClO混合，再與OPA混合，生成熒光衍生物，采用熒光光度計(jì)分析測(cè)定。（3）程序控制系統(tǒng)（4）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及其他輔助系統(tǒng)第二節(jié)氨基酸分析儀的結(jié)構(gòu)性能常見的儀器的主要性能：見表38-4（p183）3、2試樣前處理的方法第三節(jié)試樣的前處理方法（1）酸水解鹽酸水解法被破壞的：Met、Trp；不易水解：Ile、Leu、Val。過甲酸氧化法（2）堿水