質(zhì)粒的酶切-瓊脂糖凝膠電泳分離DNA課件

實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒的酶切、瓊脂糖凝

膠電泳分離DNA

實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

實(shí)驗(yàn)?zāi)康南拗菩詢?nèi)切酶切割出目的DNA了解瓊脂糖凝膠電泳的原理掌握瓊脂糖凝膠的制作及進(jìn)行電泳的方法pBCSKmap它的原理是溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中從負(fù)極向正極泳動(dòng)時(shí)，溴化乙錠從正極向負(fù)極移動(dòng)，這樣溴化乙錠分子就會(huì)嵌入DNA分子中形成絡(luò)合物，使DNA在紫外光下發(fā)射很強(qiáng)的熒光。在溴化乙錠足夠的情況下，熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，這樣就可以檢測(cè)DNA的濃度。（二）材料實(shí)驗(yàn)一中提取的質(zhì)粒DNA和酶切后的質(zhì)粒DNA。（三）試劑

1.限制性內(nèi)切酶EcoRI，2.TAE電泳緩沖液(50×)（pH8.0）

Tris242g

冰醋酸57.1ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）100ml3.溴化乙錠溶液10mg/ml水溶液，室溫，棕色瓶或鋁鉑紙包裝保存。4.10×DNA樣品上樣緩沖液5.瓊脂糖瓊脂糖凝膠制備1.洗凈電泳槽、制膠槽、梳子、擋板，晾干。2.插好擋板、梳子。3.根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需稱取0.4克瓊脂糖，放入制膠的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml電泳緩沖液（1×TAE）。4.加熱煮沸，使瓊脂糖完全溶解。5.溶液冷至約60℃時(shí)，加入溴化乙錠4μL(終濃度為0.1g/l)，輕輕搖勻，倒入制膠槽上，檢查有無氣泡。6.室溫下約30-45分鐘后，瓊脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和擋板，清除碎膠，將凝膠放入電泳槽中。7.加入電泳緩沖液（1×TAE）至電泳槽中，使液面高于膠面約1mm。

8.在DNA樣品中加入2μL(1/10體積)的10×DNA上樣緩沖液(loadingbuffer)，混勻，稍甩一下，使溶液都處于離心管底。9.用移液器吸起離心管中溶液，移入凝膠的梳孔中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中一般為三條帶，最前面的條帶為超螺旋構(gòu)型，中間為線型，最后為單鏈有缺刻的構(gòu)型。如提取過程中有機(jī)械損傷，可能在膠上出現(xiàn)彌散。影響RE(限制性內(nèi)切酶)活性的主要因素：DNA的純度；DNA的甲基化程度；溫度；緩沖液成分（DDT，BSA）等。使用3mg的DNAMarkerDL

2,000（500ng/條帶）進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳后