食品與蛋白質(zhì)工程

食品與蛋白質(zhì)工程第1頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二概述

蛋白質(zhì)是對生命至關(guān)重要的一類生物大分子物質(zhì)，各種生命功能、生命現(xiàn)象、生命活動(dòng)都和蛋白質(zhì)有關(guān)。在生命有機(jī)體催化、運(yùn)動(dòng)、結(jié)構(gòu)、識別和調(diào)節(jié)等許多方面，起著關(guān)鍵的作用。第2頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二酶.幾乎全都是蛋白質(zhì)。肌肉收縮、精子移動(dòng)、細(xì)胞分裂過程中的染色體移動(dòng).高等生物的有序生長和分化過程?？贵w蛋白能識別和結(jié)合特異性的外源物質(zhì)，使人體具備抵抗各種細(xì)菌、真菌和病毒的能力。由神經(jīng)細(xì)胞膜蛋白構(gòu)成的離子通道，負(fù)責(zé)神經(jīng)沖動(dòng)的形成和傳導(dǎo)。血紅蛋白具有結(jié)合和釋放氧的能力，是血液中氧、二氧化碳和氫離子的攜帶者。另外，人體的毛發(fā)和指甲屬于角蛋白，而血栓是由血纖蛋白單體聚合而成的。第3頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能1.催化功能：酶2.調(diào)節(jié)功能：激素3.結(jié)構(gòu)功能：皮、毛、骨、牙、細(xì)胞骨架4.運(yùn)輸功能：血紅蛋白5.免疫功能：免疫球蛋白6.運(yùn)動(dòng)功能：鞭毛、肌肉蛋白7.儲藏功能：酪蛋白8.生物膜功能：及神經(jīng)傳導(dǎo)等第4頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二

蛋白質(zhì)是生命的體現(xiàn)者，離開了蛋白質(zhì)，生命將不復(fù)存在?？墒?，生物體內(nèi)存在的天然蛋白質(zhì)，有的往往不盡人意，需要進(jìn)行改造。由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸按一定順序連接而成的，每一種蛋白質(zhì)有自己獨(dú)特的氨基酸順序，所以改變其中關(guān)鍵的氨基酸就能改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。而氨基酸是由三聯(lián)體密碼決定的，只要改變構(gòu)成遺傳密碼的一個(gè)或兩個(gè)堿基就能達(dá)到改造蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)工程的一個(gè)重要途徑就是根據(jù)人們的需要，對負(fù)責(zé)編碼某種蛋白質(zhì)的基因重新進(jìn)行設(shè)計(jì)，使合成的蛋白質(zhì)變得更符合人類的需要。

第5頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)概述一、蛋白質(zhì)工程的涵義

1.狹義：指通過改造與蛋白質(zhì)相應(yīng)的基因中的堿基順序，或設(shè)計(jì)合成新的基因，將它克隆至受體細(xì)胞中，通過基因表達(dá)而獲得具有新的特性的蛋白質(zhì)（酶）技術(shù)。

2.廣義：P56這是一門從改變基因入手，定做新的蛋白質(zhì)的技術(shù)。故有人將其稱為“第二代基因工程”1983年，美國生物學(xué)家額爾默（Ulmer）首先提出了“蛋白質(zhì)工程”的概念。第6頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二根據(jù)需要合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)；確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系；從氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能，設(shè)計(jì)合成具有特定生物功能的全新蛋白質(zhì)。

二、蛋白質(zhì)工程研究的主要內(nèi)容第7頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二三、理性分子設(shè)計(jì)和非理性分子設(shè)計(jì)1.理性分子設(shè)計(jì)：在已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上，利用改變基因中某個(gè)或某些特定核苷酸的序列，對最可能影響蛋白質(zhì)功能與性質(zhì)的基因序列進(jìn)行定位突變，有目的地改變蛋白質(zhì)的某一兩個(gè)氨基酸殘基或模塊，從而構(gòu)建全新的蛋白質(zhì)分子的技術(shù)。（P57）第8頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二2.非理性分子設(shè)計(jì)：在不清楚蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的情況下，在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬自然進(jìn)化的過程，在一定條件下使基因發(fā)生大量變異，然后通過多輪高通量的篩選方法定向選擇出所需要的特性突變我，得到具有預(yù)期新蛋白質(zhì)的技術(shù)。（P57）第9頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二四、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用1.提高酶的穩(wěn)定性2.提高酶的活力3.改變酶的選擇性第10頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二改變酶的催化活性酪氨酰tRNA合成酶Thr5151Pro改造活力25倍改變酶的專一性枯草桿菌蛋白酶活性中心枯草桿菌蛋白酶活性中心SerCys改造（水解蛋白質(zhì)）水解硝基苯酯專一性改變第11頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二通過引入“工程二硫鍵”穩(wěn)定溶菌酶構(gòu)成活性中心的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的相對位置，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性；定位突變提高其半衰期。采用盒式突變使葡萄糖異構(gòu)酶分子中酸性氨基酸集中區(qū)域用堿性氨基酸替代，從而改變酶作用的最適pH環(huán)境。第12頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二干擾素是一種抗病毒、抗腫瘤的藥物。將人的干擾素的cDNA在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生的干擾素的抗病毒活性為106U/mg，只相當(dāng)于天然產(chǎn)品的十分之一，雖然在大腸桿菌中合成的β-干擾素量很多，但多數(shù)是以無活性的二聚體形式存在。為什么會(huì)這樣？如何改變這種狀況？研究發(fā)現(xiàn)，β-干擾素蛋白質(zhì)中有3個(gè)半胱氨酸（第17位、31位和141位），推測可能是有一個(gè)或幾個(gè)半胱氨酸形成了不正確的二硫鍵。研究人員將第17位的半胱氨酸，通過基因定點(diǎn)突變改變成絲氨酸，結(jié)果使大腸桿菌中生產(chǎn)的β-干擾素的抗病性活性提高到108U/mg，并且比天然β-干擾素的貯存穩(wěn)定性高很多。第13頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)理性分子設(shè)計(jì)和定位突變技術(shù)第14頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二一、理性分子設(shè)計(jì)的主要步驟：（1）從生物體中分離純化目的蛋白；（2）測定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地了解蛋白質(zhì)的二維重組和三維晶體結(jié)構(gòu);（4）設(shè)計(jì)各種處理?xiàng)l件，了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響；（5）設(shè)計(jì)編碼該蛋白的基因改造方案，如點(diǎn)突變；（6）分離、純化新蛋白，功能檢測后投入實(shí)際使用。第15頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二二、定位突變定位突變：在已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上，在已知DNA序列中取代、插入或刪除特定的核苷酸，從而產(chǎn)生具有新性狀的蛋白質(zhì)分子的一種蛋白質(zhì)工程技術(shù)。第16頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二三、定位突變在酶結(jié)構(gòu)改造中的應(yīng)用（一）淀粉酶B.licheniformmisα-淀粉酶的雙突變體A209V/H133T，酶在90℃的半衰期延長了9倍。Mitchinson等人用定點(diǎn)突變和高通量篩選的方法得到了一個(gè)突變體，其最適pH值提高了0.5～1.0。Gloria等人用Phe或Tyr來替B.stearothermophilusα-淀粉酶289位的Ala，其具有了催化醇化反應(yīng)的能力。Sierks等人報(bào)道了通過改變葡萄糖淀粉酶活性位點(diǎn)的三個(gè)氨基酸殘基，其作用于1,4-糖苷鍵相對于1,6-糖苷鍵的Kcat/Km比值提高了300倍。第17頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二（二）蛋白酶枯草桿菌蛋白酶活性位點(diǎn)內(nèi)有一個(gè)Met殘基，利用定位突變技術(shù)用Cys代替Met可增加該蛋白酶的活力。用不可氧化氨基酸（Ser、Ala、Len）構(gòu)造的枯草桿菌蛋白酶能抗氧化，不易失活。第18頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二（三）纖維素酶Hakamada等人用定點(diǎn)突變的方法將細(xì)菌堿性纖維素酶的Glu137、Asn179和Asp194突變?yōu)長ys，其熱穩(wěn)定性得到了提高。Zhang等人專門研究了T.fusca纖維素酶Ce16A表面殘基對底物專一性的影響，發(fā)覺突變體R237A對羧甲基纖維素的活力提高了。后來他又研究了靠近活性位點(diǎn)殘基對催化活性、底物專一性、配基連接親和性的影響，4個(gè)殘基（His159、Arg237、Lys259、Glu263）的7個(gè)突變體對羧甲基纖維素的活性都有所提高，其中K259H突變體的活性提高的最為顯著。第19頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二在高溫下Asn和Gln容易脫氨形成Asp和Glu，而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變，使蛋白質(zhì)失去活性。對釀酒酵母的磷酸丙糖異構(gòu)酶進(jìn)行誘變改造。這種酶有兩個(gè)相同的亞基，每個(gè)亞基含有2個(gè)Asn，由于它們都位于亞基之間的界面上，可能對酶的熱穩(wěn)定性起決定性作用。通過寡核苷酸介導(dǎo)的定向誘變技術(shù)，將第14位和第78位上的2個(gè)Asn分別轉(zhuǎn)變成Thr(蘇氨酸)和Ile(異亮氨酸)殘基，大幅度提高突變酶的熱穩(wěn)定性。

轉(zhuǎn)化氨基酸殘基，改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性

第20頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二

改變酶的最適pH值條件

葡萄糖異構(gòu)酶最適pH為堿性，在80℃穩(wěn)定，而在堿性條件下，80℃時(shí)使高果糖漿焦化產(chǎn)生有害物質(zhì)，反應(yīng)只能在60℃進(jìn)行。采用盒式突變技術(shù)將葡萄糖異構(gòu)酶分子中酸性氨基酸(Glu或Asp)集中的區(qū)域置換為堿性氨基酸(Arg或Lys)，可使葡萄糖異構(gòu)酶的最適pH值變?yōu)樗嵝?，即可在高溫下進(jìn)行反應(yīng)第21頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二提高酶的催化活性

酶的催化活性由酶分子上的必需基團(tuán)決定如對酪氨酸-tRNA合成酶進(jìn)行定點(diǎn)突變在天然狀態(tài)下，酪氨酸-tRNA合成酶分子內(nèi)第51位蘇氨酸殘基的羥基能與底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖環(huán)上的氧原子形成氫鍵，這個(gè)氫鍵的存在影響酶分子與另一底物ATP的親和力。因此，利用定向誘變技術(shù)將酶分子第51位蘇氨酸殘基改變?yōu)楦彼釟埢?，?Pro-51)與ATP的親和力被增加了近100倍，而且最大反應(yīng)速度亦大幅度提高。第22頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二修飾酶的催化特異性

利用定點(diǎn)突變技術(shù)葡萄糖淀粉酶的催化特性。如將活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代時(shí)，突變體酶分解α-1，4糖苷鍵和α-1，4糖苷鍵的活性比例發(fā)生明顯改變修飾Nisin的生物防腐效應(yīng)

Nisin是乳酸球菌分泌的有較強(qiáng)抗菌作用的小分子肽，可用于罐頭食品、乳制品、肉制品的保藏Nisin由34個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成第23頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二改變Nisin氨基酸的序列，可增強(qiáng)其穩(wěn)定性、溶解度和擴(kuò)大抑菌譜等，擴(kuò)大Nisin的應(yīng)用范圍。Nisin分子結(jié)構(gòu)中包含5種稀有氨基酸，即ABA、DHA、DHB、ALA-S-ALA和ALA-S-ABA，它們通過硫醚鍵形成五個(gè)內(nèi)環(huán)。第24頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二蛋白質(zhì)在風(fēng)味修飾蛋白方面的應(yīng)用1、物理改性2、化學(xué)改性（1）堿處理（2）酸處理（3）琥珀?；饔茫?）乙?；饔茫?）磷酸化作用（6）酰胺化作用（7）硫醇化作用（8）酯化作用（9）糖酰化作用（10）去酰胺基作用第25頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二融合蛋白技術(shù)：通過DNA重組技術(shù)將兩個(gè)基因重組從而構(gòu)建和表達(dá)多功能新型蛋白質(zhì)的技術(shù)。融合蛋白：通過DNA重組技術(shù)得到的兩個(gè)基因重組后的表達(dá)產(chǎn)物。融合蛋白技術(shù)及其應(yīng)用第26頁，共28頁，2023年，2月20日，星期二融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用雙功能酶：

β-半乳糖苷酶-半乳糖脫氫酶融合蛋白在一定條件下，其偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生NADH的速度是同時(shí)加入這兩種酶的反應(yīng)速度的兩倍以上。同時(shí)過渡態(tài)時(shí)間縮短近四倍。靶向藥物：

定向藥物一般由兩部分組成：一部分是藥物；另一部分是可以與病灶特異性結(jié)合的配基。通過融合蛋白