重組DNA的構(gòu)建、篩選及鑒定分析課件

第十章重組DNA的構(gòu)建、篩選及鑒定分析1.重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞2.重組子的篩選3.陽(yáng)性重組子的驗(yàn)證與分析一目的基因的獲取mRNA差別顯示技術(shù)在尋找新基因工作中起到積極的作用發(fā)育機(jī)理研究雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理研究二重組DNA的構(gòu)建重組DNA的概念將目的基因（外源DNA分子）用DNA連接酶在體外連接到適當(dāng)?shù)妮d體上，即DNA分子的體外重組，這種重新組合的DNA稱為重組DNA重組DNA的構(gòu)建方法1．平末端分子的連接①連接效率還是很低；②連接常常破壞原有的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列，可能改變?cè)蠨NA的讀碼順序；③由于平末端分子兩個(gè)末端都是平的，因而在連接反應(yīng)中外源DNA分子在載體中的插人方向有正反兩種可能，增加了假陽(yáng)性；④由于都是平末端分子，可能出現(xiàn)多個(gè)平末端分子串聯(lián)后再插人到載體中的多片段“疊連”現(xiàn)象，增加了假陽(yáng)性的概率2粘性末端分子的連接 相同的粘性末端，在進(jìn)行連接時(shí)，這兩個(gè)DNA片段在DNA連接酶作用下就可以共價(jià)地連接起來(lái)，形成重組DNA三重組DNA分子導(dǎo)入受體菌轉(zhuǎn)化是感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)DNA分子的基因轉(zhuǎn)化方法

轉(zhuǎn)導(dǎo)是指通過(guò)噬菌體將一個(gè)宿主的DNA轉(zhuǎn)移到另一個(gè)宿主的細(xì)胞中而引起的基因重組現(xiàn)象顯微注射技術(shù)是一種利用顯微注射儀，通過(guò)機(jī)械方法把外源DNA直接注人細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)化方法

電轉(zhuǎn)化法也稱為電穿孔法在細(xì)胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，結(jié)果在質(zhì)膜上形成納米大小的微孔，DNA能直接通過(guò)這些微孔，或者在膜孔自行修復(fù)閉合時(shí)伴隨膜組分的重新分布而進(jìn)人細(xì)胞質(zhì)中

基因槍法，又稱微彈轟擊法是利用高速運(yùn)行的金屬顆粒轟擊細(xì)胞時(shí)能進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象，將包裹在金屬顆粒表面的外源DNA分子隨之帶人細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的基因轉(zhuǎn)化方法。轉(zhuǎn)化的目的一是大量產(chǎn)生重組DNA在完成連接反應(yīng)后，重組DNA往往只有納克級(jí)的量，不易操作和進(jìn)一步分析二是對(duì)重組DNA進(jìn)行純化。在構(gòu)建重組DNA過(guò)程中很難保證體系中不污染其他的DNA分子第二節(jié)重組子的篩選利用抗藥性基因的篩選方法抗性標(biāo)記直接篩選法載體DNA上攜帶有宿主細(xì)胞敏感的抗生素的抗性基因，pBR322質(zhì)粒載體，它上面含有的氨卞青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因抗性基因插入失活篩選法當(dāng)用某種限制性核酸內(nèi)切酶消化并在此位點(diǎn)插入外源目的DNA時(shí)，抗藥性基因不再被表達(dá)，稱為基因插入失活。因此，當(dāng)此插人外源DNA的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主菌并在藥物選擇平板上培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)對(duì)該藥物由抗性轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾羞@一特征，觀察菌落生長(zhǎng)狀況便可篩選出陽(yáng)性重組子質(zhì)粒載體抗性標(biāo)記篩選藍(lán)-白篩選

β-半乳糖苷酶可被安慰誘導(dǎo)物IPTG（異丙基硫代半乳糖苷，與乳糖結(jié)構(gòu)類似但不能被β-半乳糖苷酶降解）誘導(dǎo)的啟動(dòng)子調(diào)控之下

β-半乳糖苷酶能把培養(yǎng)基中無(wú)色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深藍(lán)色的5-溴-4-氯-靛藍(lán)營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指某菌株經(jīng)突變后，喪失了合成某營(yíng)養(yǎng)素(氨基酸，維生素，核酸等)的功能，若在培養(yǎng)基上培養(yǎng)必須添加相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)素才能生長(zhǎng)如果外源基因能夠?qū)崿F(xiàn)其功能的表達(dá),重組DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主細(xì)胞之后，則它所表現(xiàn)出來(lái)的表型性狀即可作為重組子篩選的標(biāo)記二、快速裂解菌落鑒定重組DNA分子DNA分子由于外源目的基因片段插人到質(zhì)粒載體上，所以重組質(zhì)粒的相對(duì)分子量一定比非重組質(zhì)粒要大核酸分子雜交檢測(cè)法其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸（DNA或RNA）單鏈，在一定的復(fù)性條件下，可按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈分子雜交方法可分為固相液相雜交、液相分子雜交和原位雜交Northern印跡雜交該法主要針對(duì)RNA分子的檢測(cè)由于RNA分子與硝酸纖維素膜結(jié)合能力相對(duì)較差一是防止單鏈RNA形成高級(jí)結(jié)構(gòu)，故必須采用變性凝膠電泳；二是電泳過(guò)程中始終要有效抑制RNase的作用直接把菌落或噬菌斑印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，不必進(jìn)行核酸分離純化、限制性核酸內(nèi)切酶酶切及凝膠電泳分離等操作，而是經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來(lái)并與濾膜原位結(jié)合，再與特異性DNA或RNA探針雜交，篩選出陽(yáng)性菌落或噬菌斑，即含有目的基因的重組子菌落（或噬菌斑）原位雜交菌落原位雜交技術(shù)DNA探針檢測(cè)靈敏度高；標(biāo)記方法簡(jiǎn)單；相對(duì)穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng)；特異的理化性質(zhì)如光就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列，它可以包括整個(gè)基因，也可以僅僅是基因的一部分探針的來(lái)源一種來(lái)自基因組中有關(guān)的基因本身，稱為基因組探針；另一種是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA，再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到的探針，稱為cDNA探針。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內(nèi)含子序列。在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補(bǔ)的DNA片段，稱為寡核苷酸探針。一般是通過(guò)分子克?。╩olecularcloning）獲得的?？寺∈侵赣脽o(wú)性繁殖方法獲得同一個(gè)體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。當(dāng)制備基因組DNA探針進(jìn)，應(yīng)先制備基因組文庫(kù)，即把基因組DNA打斷，或用限制性酶作不完全水解，得到許多大小不等的隨機(jī)片段，將這些片段體外重組到運(yùn)載體（噬菌體、質(zhì)粒等）中去，再將后者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸肝菌，這時(shí)在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通過(guò)原位雜交，從中可篩出含有目的基因片段的克隆，然后通過(guò)細(xì)胞擴(kuò)增，制備出大量的探針。

探針的制備cDNA探針，首先需分離純化相應(yīng)mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，就可以合成與之互補(bǔ)的DNA(即cDNA)，cDNA與待測(cè)基因的編碼區(qū)有完全相同的堿基順序，但內(nèi)含子已在加工過(guò)程中切除寡核苷酸探針是人工合成的，與已知基因DNA互補(bǔ)的，長(zhǎng)度可從十幾到幾十個(gè)核苷酸的片段。如僅知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量，也可以按氨基酸的密碼推導(dǎo)出核苷酸序列，并用化學(xué)方法合成核酸探針標(biāo)記為了獲得基因的雜交信號(hào)必須對(duì)目的基因進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記方法有熒光標(biāo)記法、生物素標(biāo)記法、同位素標(biāo)記法等四免疫化學(xué)檢測(cè)法噬菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，各種cDNA表達(dá)并呈現(xiàn)在噬菌體表面的蛋白質(zhì)便牢固地結(jié)合在膜上。然后將膜放入含有特異抗體的溶液中進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)，洗去未結(jié)合的抗體后，再與I標(biāo)記的第二抗體結(jié)合,從而找出帶有放射性示蹤信號(hào)的斑點(diǎn),進(jìn)而找出對(duì)應(yīng)噬菌斑,克隆擴(kuò)增,提取DNA后經(jīng)酶切可獲目的基因。125五DNA-蛋白質(zhì)篩選法

原理：外源DNA蛋白質(zhì)翻譯能與某一特定DNA序列結(jié)合作為探針與克隆群體雜交轉(zhuǎn)譯篩選法是通過(guò)體外轉(zhuǎn)譯的手段鑒定陽(yáng)性克隆的方法，可分為雜交抑制轉(zhuǎn)譯和雜交選擇轉(zhuǎn)譯兩種方法轉(zhuǎn)譯篩選法雜交轉(zhuǎn)譯篩選法六亞克隆法系