NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)兼

NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)

--乳酸脫氫酶釋放法石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室2013-7-5現(xiàn)在是1頁\一共有29頁\編輯于星期一目的要求熟悉乳酸脫氫酶釋放法測(cè)定NK細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè)方法。

現(xiàn)在是2頁\一共有29頁\編輯于星期一【原理】

乳酸脫氫酶(LDH)

是活細(xì)胞胞漿內(nèi)含酶之一。正常情況下，LDH不能透過細(xì)胞膜。當(dāng)靶細(xì)胞受到效應(yīng)細(xì)胞的攻擊而損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性改變，LDH可釋放至介質(zhì)中。釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)

變成還原型輔酶Ⅰ(NADH2)。后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽

(PMS)還原硝基氯化四氮唑藍(lán)(NBT)，形成有色的甲臢類化合物，在490nm或570nm波長(zhǎng)處有一高吸收峰。利用讀取的A值，經(jīng)過計(jì)算即可得知NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的活性?，F(xiàn)在是3頁\一共有29頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)原理

效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞釋放LDH丙酮酸乳酸乳酸脫氫酶(LDH)NAD+NADH+H+PMSNBT

甲臢(OD570nm）吩嗪二甲酯硫酸鹽硝基氯化四氮唑藍(lán)現(xiàn)在是4頁\一共有29頁\編輯于星期一【試劑】

1.靶細(xì)胞檢測(cè)人的NK細(xì)胞活性常用的靶細(xì)胞為體外傳代細(xì)胞株K562。2.效應(yīng)細(xì)胞從人外周血（肝素抗凝）分離的單個(gè)核細(xì)胞。3.1640培養(yǎng)液4.LDH底物溶液（臨用前配制）

NBT硝基氯化四氮唑藍(lán)4mg

NAD+I氧化型輔酶I10mg

PMS吩嗪二甲酯硫酸鹽1mg現(xiàn)在是5頁\一共有29頁\編輯于星期一【試劑】

加蒸餾水2ml溶解，混勻后取上清液1.6ml，加1mol/L乳酸鈉0.4ml，然后加入0.1mol/LpH7.4PBS至10ml。5.1%NP—40：取1mlNP-40加去離子水99ml。6.1mol/L檸檬酸終止液取檸檬酸21g加去離子水100ml現(xiàn)在是6頁\一共有29頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)步驟效應(yīng)細(xì)胞的制備（分離外周血單個(gè)核細(xì)胞）靶細(xì)胞的制備效-靶細(xì)胞相互作用酶促反應(yīng)結(jié)果判讀現(xiàn)在是7頁\一共有29頁\編輯于星期一

取培養(yǎng)24~48hr的靶細(xì)胞(K562),洗滌3次（1000rpm×10min）,最后用完全RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml,備用。靶細(xì)胞的制備：現(xiàn)在是8頁\一共有29頁\編輯于星期一效應(yīng)細(xì)胞的制備（分離外周血單個(gè)核細(xì)胞）采集靜脈血4ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝分別吸取2ml淋巴細(xì)胞分層液置10ml離心管中，將管傾斜45°，沿管壁緩緩注入抗凝血離心2000rpm×20min現(xiàn)在是9頁\一共有29頁\編輯于星期一密度梯度離心分離淋巴細(xì)胞亞群現(xiàn)在是10頁\一共有29頁\編輯于星期一用完全RPMI-1640定容細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度（加入0.2ml完全RPMI-1640，混勻，1x107）將所得PBMC用5倍體積的1640洗滌一次2000rpm×10min用毛細(xì)吸管輕輕吸去上層的血漿、稀釋液及血小板，再用另一支毛細(xì)吸管仔細(xì)吸取單個(gè)核細(xì)胞（灰白色層）現(xiàn)在是11頁\一共有29頁\編輯于星期一計(jì)數(shù)PBMC1.計(jì)數(shù)4個(gè)大方格中（即64個(gè)小方格）所有細(xì)胞數(shù)2.計(jì)數(shù)原則：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。3.總數(shù)除以4，所得數(shù)據(jù)×104即為1ml液體中的細(xì)胞總數(shù)4.每ml健康成人血可分離出1×106～2×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞現(xiàn)在是12頁\一共有29頁\編輯于星期一現(xiàn)在是13頁\一共有29頁\編輯于星期一計(jì)數(shù)PBMC舉例數(shù)4個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)分別為：87，79，91，85總數(shù)為：87+79+91+85=342一個(gè)大方格的平均數(shù)為：342/4=85.51ml液體中細(xì)胞量為：85.5×104如果用染液稀釋后計(jì)數(shù)，則細(xì)胞數(shù)為該數(shù)據(jù)的2倍。現(xiàn)在是14頁\一共有29頁\編輯于星期一效-靶細(xì)胞作用

將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各0.1ml(E/T=100:1)加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中,每份標(biāo)本設(shè)2個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放對(duì)照組

(0.1ml靶細(xì)胞+0.1mlRPMI-1640液)最大釋放對(duì)照組

(0.1ml靶細(xì)胞+0.1ml1％NP-40液),

1000r/min,2min后,置37℃、5％CO2溫箱中孵育2-4h?，F(xiàn)在是15頁\一共有29頁\編輯于星期一A123456789101112

實(shí)驗(yàn)組自然釋放組最大釋放組

123456效應(yīng)細(xì)胞（100μl）++----靶細(xì)胞（100μl）++++++RPMI1640（100μl）--++--1%NP-40（100μl）----++現(xiàn)在是16頁\一共有29頁\編輯于星期一【操作方法】酶促反應(yīng)：從37℃溫箱中取出培養(yǎng)物，吸取各孔上清0.1ml加于另一培養(yǎng)板孔中?，F(xiàn)在是17頁\一共有29頁\編輯于星期一酶促反應(yīng)置37℃預(yù)溫10min,加入新鮮配制的底物溶液0.1ml,37℃避光反應(yīng)10～15min。終止酶促反應(yīng)（用毛細(xì)吸管滴一滴1mol/L檸檬酸30μl）A123456789101112現(xiàn)在是18頁\一共有29頁\編輯于星期一結(jié)果計(jì)算

用酶標(biāo)檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)下讀取各孔OD值,并計(jì)算NK細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)組OD值-自然釋放對(duì)照組OD值NK細(xì)胞活性（%）最大釋放對(duì)照組OD值-自然釋放對(duì)照組OD值=×100%`現(xiàn)在是19頁\一共有29頁\編輯于星期一1、無論采用何種試驗(yàn)方法,靶細(xì)胞的質(zhì)量是影響細(xì)胞標(biāo)記率、自然釋放率及實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性的重要因素。一般要求靶細(xì)胞的自然釋放率<10％。2、分離PBMC時(shí)，應(yīng)用毛細(xì)吸管盡可能吸取灰白層，切勿攪動(dòng)各層。3、吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清時(shí),應(yīng)盡可能不吸動(dòng)沉淀的細(xì)胞。4、用此法測(cè)得NK活性的正常值范圍在10-40%。注意事項(xiàng):現(xiàn)在是20頁\一共有29頁\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)的原理、方法、

結(jié)果。現(xiàn)在是21頁\一共有29頁\編輯于星期一T淋巴細(xì)胞檢查1．T細(xì)胞檢查（1）T細(xì)胞花環(huán)形成試驗(yàn)

（Erythrocyterosetteformationtest,ERFT）現(xiàn)在是22頁\一共有29頁\編輯于星期一E花環(huán)形成試驗(yàn)（Erythrocyterosetteformationtest,ERFT）【目的要求】1.掌握T淋巴細(xì)胞E花環(huán)試驗(yàn)的原理、正常值，了解其方法和用途。2.熟悉光鏡下E花環(huán)的形態(tài)和計(jì)數(shù)方法?，F(xiàn)在是23頁\一共有29頁\編輯于星期一【實(shí)驗(yàn)原理】T細(xì)胞表面具有能與綿羊紅細(xì)胞（SRBC）表面糖肽結(jié)合的受體，稱為E受體（CD2）。已證實(shí)E受體是人類T細(xì)胞所特有的表面標(biāo)志。當(dāng)T細(xì)胞與SRBC混合后，SRBC便粘附于T細(xì)胞表面，呈現(xiàn)花環(huán)狀。通過花環(huán)形成檢查T細(xì)胞的方法，稱為E花環(huán)形成試驗(yàn)?，F(xiàn)在是24頁\一共有29頁\編輯于星期一根據(jù)花環(huán)形成的多少，可測(cè)知T細(xì)胞的數(shù)目，從而間接了解機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，判斷疾病的預(yù)后，考核藥物療效等?，F(xiàn)在是25頁\一共有29頁\編輯于星期一現(xiàn)在是26頁\一共有29頁\編輯于星期一【實(shí)驗(yàn)方法】淋巴細(xì)胞與SRBC按一定比例(1:10)混合

37℃5分鐘，4℃20分鐘取樣涂片瑞氏染色、鏡檢。計(jì)數(shù)E花環(huán)數(shù)，算出總花環(huán)形成率。

正常值為60%~80%。

現(xiàn)在是27頁\一共有29頁\編輯于星期一【結(jié)果觀察】高倍鏡檢查：淋巴細(xì)胞呈藍(lán)色，SRBC呈紅色圍繞淋