DNA復制修復和重組

DNA復制修復和重組演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有73頁\編輯于星期日DNA復制修復和重組現(xiàn)在是2頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是3頁\一共有73頁\編輯于星期日作為基因產物的蛋白質名稱則用第一個字母為大寫的正體字，如“RecA蛋白”。第一節(jié)DNA復制

一.關于模板的概念（template）

模板分子的概念產生于DNA雙螺旋結構建立之前，能指導子代生物大分子按特定順序合成的母鏈稱模板。二.DNA復制的基本規(guī)律

a.DNA復制是半保留的；現(xiàn)在是4頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是5頁\一共有73頁\編輯于星期日b.DNA復制在一個原點（orgin）開始，雙向進行；DNA分子復制的起點稱原點，大腸桿菌的復制原點稱OriC，終點區(qū)是ter。DNA復制點呈分叉狀，分叉狀復制區(qū)域稱復制叉。

c.DNA復制是半不連續(xù)的；

I.岡崎片斷（Okazakifragments）；II.復制叉上的前導鏈（leadingstrand）和滯后鏈（laggingstrand）；現(xiàn)在是6頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是7頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是8頁\一共有73頁\編輯于星期日三.依賴于DNA的DNA聚合酶1.E.coliDNApolymeraseI的發(fā)現(xiàn)，ArthurKornberg，1955，單肽鏈，Mr＝103,000。2.DNA聚合酶酶促反應機制(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi

引物任意脫核延長一個焦磷酸苷三磷酸核苷酸殘基

DNA聚合反應的關鍵是生長鏈的末端核苷酸的游離3’羥基對下一個參加聚合現(xiàn)在是9頁\一共有73頁\編輯于星期日

反應的脫氧核苷三磷酸中的α-磷原子發(fā)動親核進攻，建立酯鍵，釋放出焦磷酸。

DNA聚合酶催化反應的基本規(guī)律：所有DNA聚合酶都需要模板；所有DNA聚合酶都需要引物（primer）；引物：互補于模板鏈的一個寡核苷酸片斷，它帶有一個游離的3’－OH，以便建立新的磷酸二酯鍵。所有的核酸鏈聚合反應都從5‘——3’方向進行?，F(xiàn)在是10頁\一共有73頁\編輯于星期日四.DNA多聚化的熱力學

DNA聚合酶(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+Ppippi焦磷酸酶2pi＋2KJ/mol－30KJ/mol－28KJ/molΔG0’＝-28KJ/mol

現(xiàn)在是11頁\一共有73頁\編輯于星期日但由DNA聚合酶催化的上述反應在無焦磷酸酶參與下仍能繼續(xù)進行。聚合反應導致多重弱相互作用的形成，它們釋放的能量促進多聚化反應：

C－H約100KJ/mol；OH…O＝C約4-5KJ/mol；vanderWaal’s約1KJ/mol。現(xiàn)在是12頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是13頁\一共有73頁\編輯于星期日五.DNA聚合酶催化DNA聚合反應的精確性

E.coli

中的實際錯誤率10-9－10-10；

E.coli

基因組4.7×106bp；1.復制的堿基配對可以達到10-4－10-5的錯誤率。這錯誤率相當于堿基上功能基團的互變異構反應的動力學常數(shù)。2.DNA多聚酶3‘－5’外切酶活性對堿基配對的校對作用（proofreading），可以提高精度102－103倍，距離細胞內DNA復制精度還差102。校對作用不是合成的逆反應，兩種活性是獨立的。現(xiàn)在是14頁\一共有73頁\編輯于星期日以上兩個過程復制和校對，都依賴堿基配對中的非共價相互作用，這是提高信息分子復制高保真度的根本方法。六.大腸桿菌有多種DNA聚合酶1.DNApolymeraseI的特性5’－3’聚合酶活性；3’－5’外切酶活性；5’－3’外切酶活性。DNA合成速度不及復制叉移動速度的1/20，16-20nt/s；連續(xù)性太低；現(xiàn)在是15頁\一共有73頁\編輯于星期日遺傳學證據(jù)證明polA－細胞也能存活；2.II型DNA聚合酶和III型DNA聚合酶

II型參加SOS修復；

III型是主要的DNA復制酶；3.E.coliI型DNA聚合酶的兩個主要應用

a.“Nicktranslation”（切口移位技術），I型DNA聚合酶具有以雙鏈DNA的一個切口開始，用5‘－3’的外切酶活性降解這條舊鏈，并合成一條新鏈代替舊鏈，用這種技術在試管內把放射性核苷酸導入DNA，用于探針放射性的標記?，F(xiàn)在是16頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是17頁\一共有73頁\編輯于星期日

b.多聚酶鏈式反應（PCR，polymerasechainreaction），在試管內擴增一個特定基因組片斷的一個方法。4.E.coli

三種DNA聚合酶的比較現(xiàn)在是18頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是19頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是20頁\一共有73頁\編輯于星期日七.復制復合物（replisome，復制體）復制體含有20種以上的蛋白質和酶類，如DNA解螺旋酶（helicases），ssb（單鏈結合蛋白，singlestrandbindingprotein），primase（引物酶），DNApolymeraseIII，DNApolymeraseI，DNAligase（DNA連接酶），DNA拓撲酶。八.大腸桿菌染色體DNA復制的三個階段生物大分子的合成都可以分成三個階段：起始（initiation），延長（elongation），終止（termination）?，F(xiàn)在是21頁\一共有73頁\編輯于星期日1.DNA合成的起始a.大腸桿菌復制原點，OriC現(xiàn)在是22頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是23頁\一共有73頁\編輯于星期日Consensussequence（交感順序）：一個理想化了的DNA順序，這種順序中的每個位置上的堿基代表著被比較的同功能的許多順序中最常出現(xiàn)的堿基。b.起始復合物（或預引復合物，preprimingcomplex）DnaA蛋白(20copies，結合于9bp序列，以打開串聯(lián)13bp序列）；

DnaB（helicase）DNA解螺旋；

DnaC蛋白促進DnaB蛋白的結合；現(xiàn)在是24頁\一共有73頁\編輯于星期日HU類組蛋白，刺激起始；

DnaG（primase）引物酶，合成RNA物；

SSB單鏈DNA結合蛋白；

RNApolymerase促進DnaA的活性；

DNATopoisomeraseII釋放由DNA解螺旋產生的扭轉力（torsinalstrain）；c.復制起始的調節(jié)現(xiàn)在是25頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是26頁\一共有73頁\編輯于星期日2.復制中DNA鏈的延長

a.前導鏈的延長兩條鏈合成共同需要的酶：

DNAhelicase，DNATopoisomerase，SSB，DNApolymeraseIII，primase。b.滯后鏈的延長引物體（primosome）含有DnaB，DnaADnaG等七種蛋白，引物體間隔性地迫使引物酶合成含10-60核苷酸殘基長地RNA引物，DNApolymeraseIII加接脫氧核苷現(xiàn)在是27頁\一共有73頁\編輯于星期日圖12-9圖12-10現(xiàn)在是28頁\一共有73頁\編輯于星期日酸，DNApolymeraseI除去RNA引物，并合成DNA鏈代替，所留下的nick（切口）由DNA連接酶連接。

c.DNA連接酶連接具有5’－磷酸和3’－OH的切口形成磷酸二酯鍵，連接酶以NAD或ATP為能源。3.終止在原核細胞中，兩個方向相反的復制叉在染色體對相遇時復制的終止過程開始?，F(xiàn)在是29頁\一共有73頁\編輯于星期日八.真核細胞DNA的復制1.真核細胞染色體上有許多復制原點（起點），稱自體復制順序（autonomouslyreplicatingsequences，ARS），長約150bp，在yeast中，400ARS，in17chr。2.復制叉移動速度僅及細菌的1/10。3.有多個DNA聚合酶（α,ε,δ等）?，F(xiàn)在是30頁\一共有73頁\編輯于星期日第二節(jié)DNA修復（repair）一.關于突變的一些概念1.天然突變和誘變天然突變：如堿基的互變異構，宇宙線造成的突變。天然突變率稱突變的本底水平（background）。

誘導突變（inducedmutation）：補加誘變劑誘發(fā)的突變。誘變劑：引起突變的任何物理因子或化學因子稱誘變劑或誘變因子?，F(xiàn)在是31頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是32頁\一共有73頁\編輯于星期日一些生物學過程也引起突變，如病毒的感染（在染色體上的整合等）。2.突變的分類點突變：用一個堿基對替換另一個堿基對的突變。插入（insertion）和缺失（deletion）：插入和缺失都可以造成基因的框移突變（frameshiftmutation）。

無意義突變（nonsensemutation）：有意義密碼改變成終止密碼的突變?，F(xiàn)在是33頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是34頁\一共有73頁\編輯于星期日3.點突變的滲漏性a.沉默突變（silentmutation）突變不改變氨基酸殘基，CUX對應Leu，CCX對應Pro；改變氨基酸殘基但不影響基因產物的活性，如PheTyr，LeuIle；正向突變滅活一個基因的突變稱正向突變（forwardmutation）。突變的回復現(xiàn)在是35頁\一共有73頁\編輯于星期日能克服原始突變造成的影響的第二次突變稱回復突變（reversionmutation）真回復truereversion第二點回復：回復突變發(fā)生在同一基因內的第二個位點。4.突變的抑制作用（suppression）a.基因內抑制（或基因內回復，intragenicreversion），指一個補償突變恢復了原突變蛋白的活性構象；或在一個框移突變之后恢復正確的讀碼框架?，F(xiàn)在是36頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是37頁\一共有73頁\編輯于星期日b.突變的基因間回復（或基因間的抑制）第二個基因的突變排除或抑制了第一個基因突變的影響，如抑制子tRNA抑制無意義突變和錯義突變。二.腫瘤發(fā)生和Ames檢測

DNA核苷酸順序的永久性改變稱為突變，突變的積累導致動物腫瘤的發(fā)生。一般的說誘變劑是致癌物。Ames檢測法檢出致癌物：利用一株沙門氏桿菌組氨酸合成酶缺陷株。誘變劑（致癌物）可導致基因突變的回復，使之成為野生型，這原理可用檢出誘變劑。現(xiàn)在是38頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是39頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是40頁\一共有73頁\編輯于星期日三.細胞中的DNA修復系統(tǒng)細胞有多個DNA修復系統(tǒng)，為遺傳信息的完整性不惜代價。DNA修復的主要根據(jù)是以正確的互補鏈修復損傷的或錯誤的鏈。1.錯配修復（mismatchrepair）a.DNA復制后錯配堿基在模板鏈指導下的修復過程稱錯配修復，可提高復制精確率102-103倍；

b.區(qū)分模板鏈和新合成鏈依靠識別親本現(xiàn)在是41頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是42頁\一共有73頁\編輯于星期日鏈中GATC序列中的甲基化標簽（tag）；c.Dam甲基化酶甲基化DNA（A堿基的N6甲基化）；

d.錯配修復所需的酶類

Dam甲基化酶；MutH，MutL，MutS蛋白；DNAhelicaseII；SSB；DNApolymerasIII；exonucleaseI；外切酶VII；RecJ核酸酶；DNAligase。e.修復過程圖解現(xiàn)在是43頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是44頁\一共有73頁\編輯于星期日2.堿基的切割修復主要酶類：核酸糖基化酶（glycosylase），AP內切核酸酶，DNApolymeraseI，DNAligase

核酸糖基化酶識別損傷堿基，切割損傷堿基產生AP位點，由AP內切核酸酶切割AP位點的磷酸二酯鍵。3.核苷酸切割修復由uvrA，uvrB，uvrC編碼的“ABC切割核酸酶”，ABCexcinuclease切去堿基光促合成產物，切去損傷點上游8nt，下游4-5nt?，F(xiàn)在是45頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是46頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是47頁\一共有73頁\編輯于星期日4.直接修復（directrepair）a.光復活修復

DNA光解酶（photolyase）b.O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶去甲基化現(xiàn)在是48頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是49頁\一共有73頁\編輯于星期日5.差錯傾向修復（error-pronerepair）SOS反應

a.SOS反應當細胞DNA受到大量的嚴重的損傷時，誘發(fā)細胞的應急反應（SOSrespone）。此時細胞誘導產生大量應急反應所需的蛋白和酶。這種反應使細胞分裂受到抑制，溶源狀態(tài)的噬菌體被誘導進入溶菌周期，正常的DNA復制停止。同時誘發(fā)產生許多正常的DNA修復酶和特殊的現(xiàn)在是50頁\一共有73頁\編輯于星期日DNA修復－差錯傾向修復所需的酶類?，F(xiàn)在是51頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是52頁\一共有73頁\編輯于星期日b.DNApolymeraseV和translesionreplicationDNA聚合酶V能復制DNA鏈的損傷位點，造成高突變率?，F(xiàn)在是53頁\一共有73頁\編輯于星期日第三節(jié)細胞內DNA的遺傳重組（Geneticrecombination，或稱基因重排Generearrangement）一.普通重組（Generalrecombination）和位點特異性重組（site-specificrecombination）1.普通重組（依賴同源順序的重組）親本的雙鏈DNA在同源順序區(qū)域并排（聯(lián)會），通過互換同源DNA片斷形成新組合的DNA分子，這個過程稱為普通現(xiàn)在是54頁\一共有73頁\編輯于星期日遺傳重組。2.位點特異重組無需同源順序的遺傳重組，包括：

a.外來DNA在特殊染色體特殊位點的整合，如HIV，λ；b.基因轉座（transposition）

轉座是基因或某DNA順序從一個染色體轉移到另一染色體或從同一染色體的一個座位轉移到另一座位的遺傳學事件。現(xiàn)在是55頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是56頁\一共有73頁\編輯于星期日3.遺傳重組的生物學意義a.普通重組在DNA損傷的修復中起重要作用；b.重組擴大生物界遺傳多樣性，產生新的基因組合，對進化有重要意義；

c.調節(jié)基因表達，一個基因的沉默或激活可因它在染色體上的位置和取向的改變而改變，如酵母性別轉換，菌毛基因類型的改變（phasevariation）；

d.遺傳重組使抗體多樣化。現(xiàn)在是57頁\一共有73頁\編輯于星期日二.普通遺傳重組機制1.依賴于同源順序遺傳重組的細胞學證據(jù)：染色體的交叉互換現(xiàn)在是58頁\一共有73頁\編輯于星期日2.普通重組的Holliday模型（RobinHolliday，1964）a.同源DNA（homologousduplexes）并排在一起（“聯(lián)會”）；

b.內切酶切割兩并列雙鏈中各一條鏈；

c.交叉互換（crossingover）；d.交叉點移動；

e.重組中間體切割分解產生兩種不同的重組產物；現(xiàn)在是59頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是60頁\一共有73頁\編輯于星期日3.同源DNA雙鏈配對形成Chi（χ）型重組中間體的證據(jù)。

a.單體（monomer）質粒DNA在細胞內可產生頭尾相連的環(huán)形二聚體（dimer）；b.質粒同源重組中間體限制酶切割產生臂長相等的χ型產物；4.遺傳重組需要特殊的酶

a.在大腸桿菌細胞中普通遺傳重組依賴于一組rec系列基因產物，其中有recA，recB，recC，recD以及其它一些酶類，如現(xiàn)在是61頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是62頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是63頁\一共有73頁\編輯于星期日topo酶，DNA聚合酶，分解酶等。遺傳學證據(jù)：recA－（缺陷）細胞使細胞的重組率下降10-4，recA－細胞在紫外光照射后的存活率降低為10-2－10-3。

b.RecA蛋白對單鏈DNA的結合（形成絲狀體）促進與同源雙鏈DNA之間的DNA鏈互換。RecA蛋白在體外（invitro）誘發(fā)的DNA鏈交換反應；RecA蛋白介導的DNA鏈交換模型；現(xiàn)在是64頁\一共有73頁\編輯于星期日現(xiàn)在是65頁\一共有73頁\編輯于星期日5.E.coliRecBCD酶有解螺旋和內切酶活性，RecBCD復合物有ATPdrivenhelicase和nuclease活性，RecD具有內切酶活性，能切開雙鏈DNA