生物學實驗技術市公開課金獎市賽課一等獎課件

當代生物學試驗技術王希朝wangxc@第1頁第1頁第一章緒論第2頁第2頁生物科學成為當今世界自然科學熱點和重點，主要由于兩方面原因：（1）二十世紀后葉，分子生物學領域一系列突破性成就，使生命科學在自然科學中地位發(fā)生了革命性改變；（2）建立在試驗室研究基礎上生物技術發(fā)展為人類帶來了巨大利益和財富。生物技術將是未來經濟發(fā)展新動力

第一次技術革命 工業(yè)革命 解放人雙手 第二次技術革命 信息技術 擴展人大腦 第三次技術革命 生物技術 改造生命本身第3頁第3頁生物技術明顯特點

高技術（精細和密集復雜技術）

高投入（尤其是前期科研投入高）

高利潤第4頁第4頁1982年，國際合作與發(fā)展組織定義為：生物技術是應用自然科學及工程學原理，依托微生物、動物、植物體作為反應器將物料進行加工以提供產品為社會服務技術。美國政府技術顧問委員會(OAT)定義是：應用生物或來自生物體物質制造或改進一個商品技術，其還包括改良有主要經濟價值植物與動物和利用微生物改良環(huán)境技術。該定義強調了生物技術商品屬性。1、生物技術定義、主要內容和發(fā)展概況生物技術定義第5頁第5頁當代生物技術包括1、基因工程2、細胞工程3、蛋白質工程4、發(fā)酵工程5、酶工程6、生物化學工程7、生物醫(yī)學工程8、......第6頁第6頁基因工程、細胞工程、發(fā)酵工程、蛋白質（酶）工程

另外尚有基因診斷與基因治療技術、克隆動物技術、生物芯片技術、生物材料技術、生物能源技術、利用生物降解環(huán)境中有毒有害化合物技術直接相關聯(lián)學科：分子生物學、微生物學、生物化學、遺傳學、細胞生物學、化學工程學、醫(yī)藥學等。對人類和社會生活各方面影響最大生物技術領域：

農業(yè)生物技術、醫(yī)藥生物技術、環(huán)境生物技術、海洋生物技術生物技術主要內容第7頁第7頁“后基因組時代”將是“蛋白質組學時代”，即從對基因信息研究轉向對蛋白質信息研究，包括研究蛋白質結構、功效與應用及蛋白質互相關系和作用。蛋白質工程就是在對蛋白質化學、晶體學、動力學等結構與功效結識基礎上，對蛋白質人工改造與合成，最后取得商業(yè)化產品。2、蛋白質工程、發(fā)酵工程和細胞工程簡介蛋白質工程第8頁第8頁蛋白質工程主要步驟通常包含：（1）從生物體中分離純化目標蛋白；（2）測定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡也許地了解蛋白質二維重組和三維晶體結構;蛋白質工程（4）設計各種處理條件，理解蛋白質結構改變，包括折疊與去折疊等對其活性與功效影響；（5）設計編碼該蛋白基因改造方案，如點突變；（6）分離、純化新蛋白，功效檢測后投入實際使用。第9頁第9頁當代發(fā)酵工程主要指利用微生物、包括利用DNA重組技術改造微生物在全自動發(fā)酵罐或生物反應器中生產某種商品技術。當代發(fā)酵工程是生物代謝、微生物生長動力學、大型發(fā)酵罐或生物反應器研制、化工原理等密切結合和應用結果。發(fā)酵工程第10頁第10頁發(fā)酵工程普通發(fā)酵工程包括下列基本環(huán)節(jié)：（1）菌種選育；（2）細胞大規(guī)模培養(yǎng)即發(fā)酵過程；（3）生產活性誘導；（4）菌體及產物收獲發(fā)酵工程產品范圍非常廣泛。 從食品、藥物、精細化工產品到許多工業(yè)用原料、可降解塑料PHB等。第11頁第11頁細胞工程細胞工程是指通過細胞水平上篩選或改造，取得有商業(yè)價值細胞株或細胞系，再通過規(guī)模培養(yǎng)，取得特殊商品技術與過程。細胞工程包括動物細胞工程和植物細胞工程，它們分別以動物細胞和植物細胞為主要生產對象，以細胞培養(yǎng)為主要過程和內容。第12頁第12頁動物細胞培養(yǎng)細胞工程第13頁第13頁單細胞藻類培養(yǎng)細胞工程一些單細胞低等植物如單細胞藻類大規(guī)模培養(yǎng)成為細胞工程主要構成部分取得蛋白質資源、營養(yǎng)食品、精細化工產品等等第14頁第14頁高等植物細胞培養(yǎng)細胞工程高等植物細胞含有全能性。從高等植物幼胚、根、莖、葉、花和果實等不同器官組織中分離單個細胞，經過特殊培養(yǎng)形成愈傷組織，并可深入誘導生成完整植株。第15頁第15頁細胞融合、細胞重組細胞工程細胞融合是將不同種類兩種細胞經過特殊處理后放在一起，在一些促融因子作用下發(fā)生融合，形成雜種細胞。細胞重組是把不同種類細胞部件重新組合裝配，包含核移植、葉綠體移植、核糖體重建及線粒體裝配等。第16頁第16頁生物技術安全性和社會倫理問題基因一旦被改動，一方面也許引起生物體內一系列未知結構與功能變化；另一方面，轉基因操作對生物體影響會通過遺傳傳遞。轉基因技術安全性問題外源基因引入后，是否會影響其它主要調整基因，甚至會激活原癌基因？轉基因技術廣泛應用是否會造成難以毀滅新病原物出現(xiàn)？是否會造成生態(tài)學劫難？人類攝食大量轉基因食品是否會影響人類及其后代健康？第17頁第17頁克隆人倫理問題在克隆階段，假如相關胚胎發(fā)育基因重新編排或啟動不完全，對新生兒也許產生什么嚴重后果呢？弟兄、姐妹、父母、子女？器官克隆和干細胞培養(yǎng)和分化器官，用于醫(yī)學和臨床治療？個人基因信息隱私權問題人類基因信息利用倫理、法律和社會影響計劃，稱之為ELSI項目： （1）在應用和解釋基因信息時隱私權和公正性； （2）基因信息由試驗室研究向實際醫(yī)療應用轉化； （3）人類基因組計劃參與者互相協(xié)調和結果公布； （4）公眾與專業(yè)教育第18頁第18頁基因治療應用問題一個人有權決定另一個人基因結構或未來命運嗎？萬一這種基因操作失敗了或者造成了未來才干發(fā)覺不可挽回缺點和后果，誰承當責任呢？是否能夠通過基因治療操作來增長運動員身高或短跑速度，這與運動員服用興奮劑有什么本質區(qū)別？生物技術引起其它問題生物技術費用高，在本身健康上貧富差距？涉及人類本身發(fā)展主要生物技術壟斷？生物武器？……第19頁第19頁第二章細胞培養(yǎng)第20頁第20頁細胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料品清洗與消毒清洗在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞對任何有害物質都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細胞生長微生物產品附帶雜物上次細胞殘留物非營養(yǎng)成份化學物質需要清洗培養(yǎng)用具玻璃器皿清洗膠塞清洗塑料制品清洗第21頁第21頁玻璃器皿清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個環(huán)節(jié)清洗后玻璃器皿潔凈透明無油跡不能殘留任何物質第22頁第22頁浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉新初次使用玻璃器皿，在生產及運送過程中，玻璃表面帶有大量干固灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細胞有害物質等先用自來水簡樸刷洗，然后晾干，再浸酸再次使用玻璃器皿則常附有大量剛使用過蛋白質，干固后不易洗掉用后馬上浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上第23頁第23頁刷洗用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢雜質透明塑料制品刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度第24頁第24頁浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉微量雜質浸泡時器皿要充斥清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面浸泡時間：普通為過夜，不應少于6小時清潔液慣用三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）

強清潔液63∶1000∶00次強清洗液120∶200∶1000弱清潔液100∶100∶100配制時應注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不斷用玻璃棒攪拌，使產生熱量揮發(fā)，配制溶液應選擇塑料制品。配成后清潔液普通為棕紅色

第25頁第25頁沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充足沖洗。使之盡也許不留污染或清潔液殘跡最好用洗滌裝置如用手工操作需流水沖洗二十次，每次水須灌滿及倒?jié)崈?，最好用蒸餾水清洗3-5次，三蒸水清洗3次，晾干或烘干備用第26頁第26頁膠塞清洗新購買瓶塞帶有大量滑石粉及雜質，應先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理常規(guī)清洗辦法每次用后馬上置入水中浸泡，用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘（以除掉培養(yǎng)中蛋白質），自來水沖洗，蒸餾水沖洗2-3次，晾干備用第27頁第27頁塑料制品清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經特殊處理包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品必要時用2%NaOH浸泡過夜，用自來水充足沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗潔凈，晾干備用第28頁第28頁消毒細胞培養(yǎng)最大危險是發(fā)生培養(yǎng)物細菌、真菌和病毒等微生物污染常見原因：操作間或周圍空間不潔培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底由于相關培養(yǎng)每個環(huán)節(jié)失誤均能造成培養(yǎng)失敗，故細胞培養(yǎng)每個環(huán)節(jié)都應嚴格遵守操作常規(guī)，預防發(fā)生污染第29頁第29頁消毒滅菌辦法物理消毒滅菌法紫外線：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒培養(yǎng)器皿，30min濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121℃，20min干烤：160℃,2小時過濾：0.22μm化學消毒滅菌法70%酒精主要用于操作者皮膚，操作臺表面及無菌室內壁面處理1‰新潔爾滅主要用于器械浸泡及皮膚和操作室壁面擦試消毒抗生素主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預防培養(yǎng)物污染第30頁第30頁化學消毒法70%酒精主要用于操作者皮膚，操作臺表面及無菌室內壁面處理1‰新潔爾滅主要用于器械浸泡及皮膚和操作室壁面擦試消毒第31頁第31頁細胞培養(yǎng)慣用物品細胞培養(yǎng)基市場上可提供干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其長處是價格廉價。缺點是配制過程繁瑣，質量不易控制液體培養(yǎng)基是由專業(yè)廠家按原則規(guī)?；a，不但質量得到確保，并且使用十分以便慣用培養(yǎng)基種類RPMI-1640（原則型）、DMEM-高糖（原則型）、DMEM-低糖（原則型）、McCoys5A、M199、F10等第32頁第32頁血清熱滅活：56℃,30分鐘加熱已完全解凍血清熱滅活目的：滅活血清中補體成份。除非必須，普通不提議作熱滅活處理，由于熱處理睬造成血清沉淀物明顯增多，還會影響血清質量血清中沉淀物絮狀物：血清中脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身質量?？捎秒x心3000rpm,5分鐘清除，也可不用處理顯微鏡下“小黑點”：通過熱處理過血清，沉淀物形成會明顯增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀測象“小黑點”，常誤認為血清受污染。普通情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但假如懷疑血清質量，則應馬上停止使用，更換另一批號血清第33頁第33頁平衡鹽液體組織細胞培養(yǎng)中慣用基本液體，能夠維持滲入壓、調整pH值、供應細胞生存所需能量和無機離子成份用于洗滌組織、細胞等第34頁第34頁PBS（Phosphate-BufferedSallines）KCl0.20gKH2PO40.20gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16gDPBS（Dulbecco’sPhosphate-BufferedSallines）原則型CaCl2(anhyd.)(無水氯化鈣)0.10gKCl0.20gKH2PO40.20gMgCl2·6H2O0.10gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16g第35頁第35頁Hanks’平衡鹽溶液（Hanks’BalancedSaltSolutions，HBSS）CaCl2(anhyd.)(無水氯化鈣)0.14gKCl0.40gKH2PO40.06gMgCl2·6H2O0.10gMgSO4·7H2O0.10gNaCl8.00gNa2CO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g第36頁第36頁D-Hanks’平衡鹽溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNaCO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g

第37頁第37頁消化液分離組織和分散細胞慣用有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液單獨或混合使用第38頁第38頁胰蛋白酶溶液主要作用：使細胞間蛋白質水解，使細胞互相離散消化細胞時，加入一些血清或含血清培養(yǎng)液，能終止消化作用第39頁第39頁胰蛋白酶溶液配制稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks平衡鹽溶液調成糊狀，再補足D-Hanks平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱保留備用，慣用濃度為0.25%（0.1%-0.5%）胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可調用碳酸氫鈉溶液調pH至7.2左右保留條件：配制好胰蛋白酶溶液必須保留在-20℃冰箱中，以免分解失效第40頁第40頁EDTA·4Na溶液一個化學螯合劑，對細胞有一定離散作用，并且毒性小，價格低廉，使用以便慣用工作液濃度為0.02%。通常與0.25%胰蛋白酶溶液按1：1混合使用（混合液）

注意：使用EDTA處理細胞后，要用Hanks液沖洗潔凈，因殘留EDTA會影響細胞生長EDTA溶液配制：用D-Hanks’平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4℃冰箱保留第41頁第41頁pH調整液NaHCO3溶液慣用濃度為7.5%。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保留HEPES（分子量238.31）溶液使用終濃度普通為10-50mM常配成1M儲存液：用200ml雙蒸水溶解47.6克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保留第42頁第42頁酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH批示紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫色表示堿性pH在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅由于已有一些研究表明：酚紅能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用第43頁第43頁抗生素溶液抗生素使用種類與濃度：

工作濃度

儲存溫度

殺滅細菌

penicillin100units/ml-20℃G(+)

streptomycin100ug/ml-20℃G(+)、G(-)

gentamicin50ug/ml-20℃G(+)、G(-)、支原體

amphotericinB2.5ug/ml-20℃

真菌

nystatin50ug/ml-20℃真菌

第44頁第44頁器材和液體準備細胞培養(yǎng)用玻璃器材培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗潔凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，160℃，2小時干烤滅菌后備用手術器材、瓶塞、配制好PBS液15磅，121℃，20分鐘蒸氣滅菌MEM培養(yǎng)液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾后備用

第45頁第45頁無菌操作中注意事項在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)無菌清潔操作前無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面，并啟動無菌操作臺風扇運轉10分鐘操作時，小心取用無菌之試驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作試驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用在整個無菌操作過程中都應當在酒精燈周圍進行第46頁第46頁哺乳動物細胞冷凍保留冷凍保留要點冷凍過程要緩慢。4℃30－60分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時（或過夜）→液氮長期保留凍存細胞必須處于對數(shù)生長期，活力不小于90％，無微生物污染。細胞濃度控制在：1×107－5×107/ml。慣用細胞冷凍保留液10％DMSO＋完全細胞生長培養(yǎng)液（20％血清＋基礎培養(yǎng)液）10％甘油＋完全細胞生長培養(yǎng)液（20％血清＋基礎培養(yǎng)液）

第47頁第47頁冷凍保留細胞解凍與復蘇要點快速解凍凍存細胞從液氮中取出后，馬上放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內所有融化（不要超出3分鐘）解凍后細胞可直接接種到含完全生長培養(yǎng)液細胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以清除DMSO假如細胞對冷凍保護劑尤其敏感解凍后細胞應先通過離心清除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液培養(yǎng)瓶中第48頁第48頁解凍冷凍保留細胞離心辦法從液氮中取出凍存細胞，馬上放入37℃水浴中快速解凍將1－2ml凍存細胞液加入到25ml新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液中，輕輕混勻用80g離心2－3分鐘，棄上清液用完全生長培養(yǎng)液輕輕懸浮細胞團，并計數(shù)細胞接種細胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為3×105/ml。第49頁第49頁細胞原代和傳代培養(yǎng)第50頁第50頁原代細胞培養(yǎng)原理細胞培養(yǎng)是模擬機體內生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題研究。由體內直接取出組織或細胞進行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細胞離體時間短，性狀與體內相同，適合用于研究。幼稚狀態(tài)組織和細胞，如：動物胚胎、幼仔臟器等更容易進行原代培養(yǎng)第51頁第51頁原代細胞培養(yǎng)操作（鼠胎組織細胞培養(yǎng)為例）取材：用頸椎脫位法使孕鼠快速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75％乙醇燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污切割：用平衡鹽溶液將取出組織塊清洗三次，然后用眼科手術剪刀仔細將組織重復剪碎，直到成1mm3左右小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清消化、接種培養(yǎng)：加入0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液（5~10倍量），與組織塊混勻。置37℃水浴，觀測消化情況（每隔幾分鐘搖動一下試管），靜止，吸去上清，加入5～10ml完全生長培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)第52頁第52頁原代細胞培養(yǎng)結果細胞接種后普通幾小時內就能貼壁，并開始生長如接種細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層第53頁第53頁傳代細胞培養(yǎng)原理體外培養(yǎng)原代細胞或細胞株要在體外連續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，方便取得穩(wěn)定細胞株或得到大量同種細胞，并維持細胞種延續(xù)培養(yǎng)細胞形成單層匯合以后，因為密度過大生存空間不足而引發(fā)營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)細胞分散，沉著器中取出，以1:2或l:3以上比率轉移到另外容器中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3～6次第54頁第54頁傳代細胞培養(yǎng)操作將長成單層細胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內培養(yǎng)液，加入少許消化液。(以液面蓋住細胞為宜)，靜置5～10分鐘在倒置鏡下觀測被消化細胞，假如細胞變圓，互相之間不再連接成片，這時應馬上在超凈臺中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細胞懸液將細胞懸液吸出2ml左右，加到另一個培養(yǎng)瓶