葉酸代謝能力基因檢測(cè)操作流程

MTHFRC677T,MTHFRA1298C,MTRRA66G基因檢測(cè)操作流程實(shí)驗(yàn)流程樣本采集 基因組DNA提取 RCR樣本采集 基因組DNA提取 RCR擴(kuò)增佶息L錄入亠」」結(jié)果報(bào)告結(jié)果判讀一、操作步驟適用儀器：普通PCR儀樣本要求：EDTA抗凝劑的靜脈全血（100回），室溫保存不超過(guò)7天，2?8□保存不超過(guò)1個(gè)月，-20□保存不超過(guò)3個(gè)月，反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò)5次；DNA的濃度應(yīng)不低于5ng/pl, A260/A280應(yīng)在1.6?2.0之間。有血塊的樣本需經(jīng)勻漿處理或用組織研磨儀研磨處理后再進(jìn)行全血DNA的提取。檢驗(yàn)方法：（試劑盒中的檢本測(cè)卡、陽(yáng)性/陰性對(duì)照卡上標(biāo)識(shí)解釋如下：M表示突變型，WT表示野生型，C表示質(zhì)控線，T表示檢測(cè)線。A：樣本DNA的制備試劑盒準(zhǔn)備工作：1、 清洗液BW-I：用50ml量筒分別移取35ml無(wú)水乙醇（分析純）和35ml異丙醇加入至清洗液BW-I試劑瓶中，顛倒混合均勻，在試劑瓶上標(biāo)明“已加入醇”和日期，備用。2、 清洗液BW-II:用50ml量筒移取49ml無(wú)水乙醇加入至清洗液BW-II試劑瓶中，顛倒混合均勻，在試劑瓶上標(biāo)明“已加入醇”和日期，備用。3、 蛋白酶K準(zhǔn)備：取出蛋白酶K,室溫解凍，渦旋混勻后備用。4、 磁性微粒準(zhǔn)備：將磁性微粒渦旋混勻，保證均一。實(shí)驗(yàn)操作步驟：將20口1蛋白酶K溶液加入2ml離心管的管底。依次加入100口1全血、200口1裂解液BL，用渦旋振蕩器混合15sec（以下簡(jiǎn)稱(chēng)渦旋混勻），56°C水浴20min。向步驟1裂解處理的樣品中依次加入300口1結(jié)合液BI、25口1的磁性微粒（移取前必須充分渦旋混勻），渦旋混勻，室溫靜置5min。磁性分離5min，棄上清。從磁性分離器上取出離心管，加入400口1清洗液BW-I，渦旋混勻，磁性分離至上清澄清（期間上下顛倒數(shù)次，以清洗離心管管壁），棄上清；重復(fù)本步操作，以400口1清洗液BW-I重復(fù)清洗一次。從磁性分離器上取出離心管，加入400口1清洗液BW-II，渦旋混勻，磁性分離至上清澄清（期間上下顛倒數(shù)次，以清洗離心管管壁），棄上清（盡可能棄去所有的清洗液BW-II）。打開(kāi)離心管蓋，將其室溫晾干5min。從磁性分離器上取下離心管，向管中加入100口1洗脫液ES，渦旋混勻，56C水浴5min。將離心管置于磁性分離器上，磁性分離至上清澄清。將上清液（分離純化得到的DNA溶液）轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，直接用于下游實(shí)驗(yàn)或于-20C保存?zhèn)溆谩：PCR擴(kuò)增液準(zhǔn)備（1）每人份需做兩個(gè)反應(yīng)，取兩個(gè)無(wú)菌0.2mlPCR薄壁管，在PCR薄壁管管蓋上依次標(biāo)有M、WT。（2）將試劑從-20□取出平衡至室溫，瞬時(shí)離心。在標(biāo)有M的管中加入29卩1擴(kuò)增液（M）,在標(biāo)有WT的管中加入29卩1擴(kuò)增液（WT）。（3）分別向以上M和WT各管中加入1卩1反應(yīng)液。將管蓋蓋緊后，渦旋混勻，瞬時(shí)離心待用。C：待檢測(cè)DNA樣本的配制在上述標(biāo)有M、WT管中分別加入3卩1待測(cè)基因組DNA,分別再加入17卩1ddH20使終體積為50卩1。將管蓋蓋緊后，渦旋混勻，瞬時(shí)離心。D：PCR擴(kuò)增將PCR管放入PCR儀中，按如下程序擴(kuò)增：50口2min；95口5min；94口30sec、60口30sec、65口1min（26Cycles）；65口10min； 4口Hold。取出PCR產(chǎn)物，2~8□保存。E：檢測(cè)卡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)從密封袋中取出檢測(cè)卡，將待測(cè)樣本M與WT管中的PCR產(chǎn)物分別滴加在檢測(cè)卡對(duì)應(yīng)的樣品墊處，待2~5min對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，20min后結(jié)果不可靠。F：質(zhì)量控制（1） 檢測(cè)結(jié)果中陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)在陽(yáng)性對(duì)照卡檢測(cè)線（T線）出條帶，陰性對(duì)照應(yīng)在陰性對(duì)照卡檢測(cè)線（T線）不出條帶。正常檢測(cè)時(shí)，應(yīng)定期進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照品及陰性對(duì)照品實(shí)驗(yàn)。（2） 陽(yáng)性對(duì)照品實(shí)驗(yàn)：取兩個(gè)無(wú)菌0.2m1PCR薄壁管，在PCR薄壁管管蓋上依次標(biāo)有M、WT，將20卩1M陽(yáng)性對(duì)照液、20卩1WT陽(yáng)性對(duì)照液分別加入標(biāo)有M、WT的PCR薄壁管中，再依次分別加入M擴(kuò)增液29卩1及1卩1反應(yīng)液、WT擴(kuò)增液29卩1及1卩1反應(yīng)液，按照步驟中D~F完成，檢測(cè)線（T線）及質(zhì)控線（C線）均應(yīng)出現(xiàn)條帶。（3） 陰性對(duì)照品實(shí)驗(yàn)：取兩個(gè)無(wú)菌0.2m1PCR薄壁管，在PCR薄壁管管蓋上依次標(biāo)有M、WT，將M擴(kuò)增液29卩1、1卩1反應(yīng)液及WT擴(kuò)增液29卩1、1卩1反應(yīng)液分別加入標(biāo)有M、WT的PCR薄壁管中，再分別加入20卩1陰性對(duì)照液，按照步驟中D~F完成，質(zhì)控線（C線）應(yīng)出現(xiàn)條帶，檢測(cè)線（T線）應(yīng)無(wú)條帶出現(xiàn)。G：結(jié)果判讀（如下圖、下表）如上圖一所示，以陽(yáng)性對(duì)照液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)線（T線）有條帶出現(xiàn)，作為陽(yáng)性對(duì)照；以陰性對(duì)照液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)線（T線）無(wú)條帶出現(xiàn)，為陰性對(duì)照。若陰性樣本有條帶出現(xiàn)，有可能加樣時(shí)未及時(shí)更換吸頭，有DNA污染，建議在操作過(guò)程中，先配制陰性對(duì)照管并及時(shí)閉合PCR管蓋。圖二顯示MTHFR677CC表示正常野生型；圖三顯示MTHFR677TT表示一對(duì)等位基因的第677位胞嘧啶（C）均變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）,即純合突變；圖四顯示MTHFR677CT表示其中一個(gè)等位基因的第677位胞嘧啶（C）變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）,即雜合突變；圖五質(zhì)控線（C線）無(wú)條帶或質(zhì)控線（C線）與檢測(cè)線（T線）均無(wú)條帶，即為無(wú)效檢測(cè)。無(wú)效原因可能為操作不正確或試紙條已變質(zhì)損壞。應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，并用新的檢測(cè)卡重新檢測(cè)。如果問(wèn)題仍然存在，應(yīng)立即停止使用該批號(hào)產(chǎn)品，并與廠家或供應(yīng)商聯(lián)系。MWT■c■■C■T圖二野生型MWT■c■■C■T圖二野生型圖三純合突變MWT圖四雜合突變圖五無(wú)效圖H:注意事項(xiàng)（1）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該遵循PCR實(shí)驗(yàn)規(guī)范的要求分區(qū)操作，各區(qū)物品均為專(zhuān)用，不得交叉使用，加模板和引物的移液器不能混用，每次加樣后均需更換吸頭，推薦使用無(wú)核酶、帶濾芯的吸頭。各區(qū)的儀器、設(shè)備和工作月服應(yīng)獨(dú)立使用。（2） 本試劑盒用于體夕b操作。用戶切勿吸入試劑或直接接觸皮膚。（3） 使用本試劑盒前，請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的要求操作。打開(kāi)包裝后請(qǐng)盡快使用。（4）使用本試劑盒時(shí)，因PCR體系為50山體系，應(yīng)使用200山的PCR擴(kuò)增管進(jìn)行操作。（5）本試劑盒備有"PCR組分加入確認(rèn)單"，在【檢測(cè)方法】中的步驟B（PCR