DB42T 1586-2020牛沙門氏菌病診斷技術(shù)規(guī)程

ICS11.220CCSB41湖DB42Diagnostictechnicalguidelineforbovinesalmonel湖北省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB42/TXXXX—2020 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14縮略語(yǔ) 15臨床初步診斷 16實(shí)驗(yàn)室診斷 26.1檢驗(yàn)程序 26.2主要儀器與耗材 26.3培養(yǎng)基和試劑 26.4操作步驟 37診斷檢驗(yàn)流程 58結(jié)果判定 58.1結(jié)果記錄與判定 58.2診斷報(bào)告 5附錄A（規(guī)范性）試劑配制（分析純） 6附錄B（資料性）牛沙門氏菌診斷結(jié)果記錄表 7附錄C（資料性）牛沙門氏菌病診斷檢驗(yàn)流程圖 8DB42/TXXXX—2020本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件的附錄A為規(guī)范性附錄，附錄B和附錄C為資料性附錄。本文件由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本文件由湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本文件起草單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、湖北勁牛牧業(yè)有限公司、松滋市春珍肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)、隨州市弘大畜牧有限責(zé)任公司。本文件主要起草人：郭愛(ài)珍、王杰、陳穎鈺、王宇、王琛、胡長(zhǎng)敏、栗紹文、陳煥春、彭清潔、曹永強(qiáng)、周春、曾穩(wěn)兵。本標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施應(yīng)用中的疑問(wèn)，可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話郵箱：hbsnab@126.com；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，聯(lián)系電話郵箱：xys@。aizhen@。1DB42/TXXXX—2020牛沙門氏菌病診斷技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了牛沙門氏菌病的臨床初步診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷、診斷檢驗(yàn)流程及結(jié)果判斷的技術(shù)要求。本文件適用于湖北省范圍內(nèi)牛沙門氏菌病的診斷、檢疫與監(jiān)測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T4789.4食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。bp：堿基對(duì)（basepair）BPW：緩沖蛋白胨水（bufferedpeptonewater）BS：亞硫酸鉍（bismuthsulfite）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）EP：微型離心管（eppendorftube）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）stn：沙門氏菌腸毒素基因（salmonellaenterotoxingene）TAE：三羥甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸緩沖液（trisbase,aceticacidandethylenediaminetetraaceticacidbuffer）TTB：四硫磺酸鈉煌綠增菌液（tetrathionatebroth）5臨床初步診斷對(duì)犢牛進(jìn)行臨床觀察，體溫升高至40℃~41℃,精神沉郁，呼吸加快，食欲降低或廢絕，出現(xiàn)明顯腹瀉癥狀，排出黃色或灰黃色難聞稀糞，或排泄物含黏膜碎片和黏液或血絲，或呈血湯樣者，初步判2DB42/TXXXX—2020定為犢牛沙門氏菌病。填寫附錄B，將“臨床初步診斷”欄記錄為“+”并進(jìn)行下一步操作。否則判定為無(wú)沙門氏菌病。6實(shí)驗(yàn)室診斷6.1檢驗(yàn)程序包括病料預(yù)增菌、PCR初篩、可疑菌落生化鑒定和PCR驗(yàn)證、血清型鑒定等步驟。6.2主要儀器與耗材6.2.1儀器儀器主要包括：a)渦旋儀；b）恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃,42℃c）水浴鍋；離心機(jī)；PCR儀；紫外燈；i）超凈工作臺(tái)或生物安全柜。6.2.2耗材耗材主要包括：a）EP管和離心管：容量1.5mL、10mL、15mL；b）培養(yǎng)皿：直徑90mm；c）PCR反應(yīng)管；d）無(wú)菌棉簽；e）接種環(huán)。6.3培養(yǎng)基和試劑6.3.1BPW培養(yǎng)基相關(guān)試劑配制應(yīng)符合附錄A.1的規(guī)定。6.3.2TTB增菌液相關(guān)試劑應(yīng)符合附錄A.2的規(guī)定。6.3.3BS瓊脂培養(yǎng)基相關(guān)試劑應(yīng)符合附錄A.3的規(guī)定。6.3.4三羥甲基氨基甲烷、乙酸和TAE緩沖液3DB42/TXXXX—2020相關(guān)試劑應(yīng)符合附錄A.4的規(guī)定。6.3.5瓊脂糖相關(guān)試劑應(yīng)符合附錄A.5的規(guī)定。6.3.6生化鑒定試劑商業(yè)化生化管或生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。6.3.7沙門氏菌鼠傷寒標(biāo)準(zhǔn)株商業(yè)化鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。6.4操作步驟6.4.1病料的采集將用BPW增菌液充分潤(rùn)濕的無(wú)菌棉簽插入肛門攪動(dòng)3～5圈后置于裝有5mLBPW增菌液的10mL規(guī)格離心管中，冷藏條件下在24h之內(nèi)送檢。所有樣本均須妥善包裝，防滲漏，防破碎。標(biāo)記信息完整、清晰，并附采樣單。6.4.2預(yù)增菌將5.4.1中裝有樣品的離心管用渦旋儀振蕩1min，置于36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h～18吸取5μL沙門氏菌參考菌株純培養(yǎng)物于裝有5mLBPW增菌液的EP管中，充分混合后，置于36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h～18h，作為陽(yáng)性對(duì)照。吸取5μL滅菌生理鹽水于裝有5mLBPW增菌液的EP管中，充分混合后，置于36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h～18h，作為空白對(duì)照。6.4.3選擇性增菌將5.4.2中培養(yǎng)好的混合物輕輕搖動(dòng)混勻，在無(wú)菌條件下吸取1mL轉(zhuǎn)接于裝有10mLTTB的15mL離心管中，置于42℃±1℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h～24h?？蛇x擇繼續(xù)5.4.4操作步驟或直接進(jìn)入5.4.5操作步驟。6.4.4PCR初篩檢測(cè)引物針對(duì)沙門氏菌stn基因設(shè)計(jì)特異性引物后并合成。序列如下：a)上游引物：5'CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG3'；b)下游引物：5'TGCCCAAAGCAGAGAGATTC3'。模板提取將5.4.3中的3種培養(yǎng)物輕輕混勻。各吸取1mL培養(yǎng)物于1.5mL無(wú)菌EP管中，10000r/min離心5min，棄上清，加入0.2mL無(wú)菌去離子水充分混合分散，于8000r/min離心2min，棄上清，再加入0.2mL無(wú)菌去離子水充分混合分散，再于8000r/min離心2min，棄上清后用0.1mL無(wú)菌去離子水充分混合分散，4DB42/TXXXX—2020用水浴鍋煮沸10min后迅速移至碎冰塊上，使其迅速冷卻10min。最后用8000r/min離心2min，吸取上清，做為模板備用。PCR反應(yīng)體系總體積25μL：將2×TaqMixture12.5μL，模板2μL，上下游引物（濃度為10μΜ/μL）各0.5μL，去離子水9.5μL，加入PCR反應(yīng)管中，充分混合。PCR反應(yīng)程序?qū)⒅蠵CR反應(yīng)管放置于PCR儀中，設(shè)定反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃4min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：94℃1min，56℃0.5min，72℃0.5min，循環(huán)35次，72℃10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，100V，100mA條件下電泳40min。紫外燈下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物，陽(yáng)性對(duì)照PCR產(chǎn)物大小為260bp，空白對(duì)照PCR產(chǎn)物無(wú)條帶時(shí)，反應(yīng)成立。當(dāng)樣本PCR產(chǎn)物與陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)物大小一致時(shí)（260bp），繼續(xù)下一步操作。當(dāng)樣本PCR產(chǎn)物與陽(yáng)性對(duì)照產(chǎn)物大小不一致時(shí)，表明樣本無(wú)沙門氏菌。6.4.5細(xì)菌分離培養(yǎng)用直徑為3mm的接種環(huán)接取5.4.3中培養(yǎng)液1環(huán)，劃線接種于BS瓊脂培養(yǎng)基，于36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40h～48h，觀察菌落形態(tài)。當(dāng)呈現(xiàn)下列形態(tài)時(shí)，填寫附錄B中表B.1，將“細(xì)菌分離培養(yǎng)”欄記錄為“+”并繼續(xù)5.4.6操作步驟或5.4.7操作步驟（二者選其一操作即可）：菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或者灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色，或菌株形成灰綠色的菌落，但周圍培養(yǎng)基顏色不變。否則表明樣本無(wú)沙門氏菌。6.4.6PCR鑒定可疑菌落用接種環(huán)蘸取5.4.5培養(yǎng)物中典型菌落大小的一半置于裝有50μL無(wú)菌去離子水的無(wú)菌PCR反應(yīng)管中，在渦旋儀上渦旋10s后煮沸10min，迅速移至碎冰中冷卻10min后8000r/min離心2min，吸取上清做為PCR模板。依照和所示方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，依照所示方法進(jìn)行PCR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)，并將PCR產(chǎn)物送商業(yè)公司測(cè)序，與stn基因進(jìn)行同源性比較，同源性在99%以上時(shí)填寫附錄B，將“PCR鑒定可疑菌落欄”記錄為“+”并繼續(xù)5.4.8操作。否則表明該樣本無(wú)沙門氏菌。6.4.7生化鑒定挑取5.4.5中2個(gè)以上典型菌落，使用商業(yè)化的生化管或者生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)，按照GB4789.4中5.4中的步驟進(jìn)行生化試驗(yàn)和判定。符合沙門氏菌生化特征則填寫附錄B表B.1，將“生化鑒定”欄記錄為“+”并進(jìn)行下一步操作。否則樣本判定為無(wú)沙門氏菌。可選擇5.4.8進(jìn)行血清學(xué)鑒定，或直接進(jìn)行結(jié)果判定。6.4.8血清學(xué)鑒定5DB42/TXXXX—2020挑取5.4.5菌落后按照GB4789.4中5.5規(guī)定執(zhí)行。符合沙門氏菌血清學(xué)特征則應(yīng)按照附錄B中表B.1填寫，將“血清學(xué)鑒定”欄記錄為相應(yīng)血清學(xué)鑒定結(jié)果。7診斷檢驗(yàn)流程牛沙門氏菌病診斷檢驗(yàn)流程見(jiàn)附錄C。所有污染材料、多余樣本和細(xì)菌培養(yǎng)物等廢棄物應(yīng)依照GB19489要求進(jìn)行。消毒滅菌后按照國(guó)務(wù)院令第424號(hào)要求作為醫(yī)療廢物處理。8結(jié)果判定8.1結(jié)果記錄與判定完成牛沙門氏菌診斷結(jié)果記錄，并與表1進(jìn)行比對(duì)，符合1、2中任意一條則可確診牛病為牛沙門氏菌病。表1牛沙門氏菌病診斷結(jié)果記錄表1+++2+++8.2診斷報(bào)告依據(jù)診斷結(jié)果出具診斷報(bào)告。6DB42/TXXXX—2020（規(guī)范性）試劑配制（分析純）本附錄規(guī)定了實(shí)驗(yàn)室診斷中所需試劑的配方和配制方法。A.1BPW培養(yǎng)基2%緩沖蛋白胨水：將2.0g緩沖蛋白胨水加入蒸餾水定容至100mL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15min。冷卻至室溫，備用。A.2TTB增菌液A.2.1碘溶液將25.0g碘化鉀充分溶解于少量的蒸餾水中，再投入20.0g碘片，攪拌充分溶解后加蒸餾水定容至100mL，貯存于棕色瓶?jī)?nèi)，塞緊瓶蓋備用。A.2.2煌綠水溶液0.5%煌綠水溶液：將0.5g煌綠加入蒸餾水定容至100mL，充分溶解后存放于暗處，不少于1d。A.2.3四硫磺酸鈉煌綠增菌液將4.6g四硫磺酸鈉煌綠基礎(chǔ)培養(yǎng)基加熱溶解于適量蒸餾水中，定容至100mL，121℃高壓滅菌15min，冷卻至室溫。臨用前，每100mL培養(yǎng)基加入碘溶液2.0mL和煌綠水溶液1.0mL，混勻均勻，備用。A.3BS瓊脂培養(yǎng)基5%亞硫酸鉍瓊脂：將5.0g亞硫酸鉍瓊脂加入蒸餾水定容至100mL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，冷卻至45℃~50℃時(shí)，輕輕搖勻后倒入無(wú)菌平皿中備用。暗處保存，48h內(nèi)使用。A.4三羥甲基氨基甲烷、乙酸和TAE緩沖液將24.2g三羥甲基氨基甲烷和3.7g二水合乙二胺四乙酸二鈉加入適量去離子水中，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加?.