生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座

第一節(jié)概述

哺乳動(dòng)物生育繁殖過(guò)程外源化學(xué)物對(duì)生殖發(fā)育影響外源化學(xué)物對(duì)生殖發(fā)育影響以及損害作用特點(diǎn)

生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第1頁(yè)哺乳動(dòng)物生育繁殖過(guò)程

生殖發(fā)育是哺乳動(dòng)物繁衍種族生理過(guò)程，其中包含生殖細(xì)胞發(fā)生，即精子發(fā)生和卵細(xì)胞發(fā)生、配子釋放、性周期和性行為、卵細(xì)胞受精、受精卵卵裂、胚泡形成、植入或著床、胚胎形成、胚胎發(fā)育、器官發(fā)生（或稱器官形成）、胎仔發(fā)育、分娩和哺乳過(guò)程。生殖發(fā)育也可稱繁殖過(guò)程。概述生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第2頁(yè)外源化學(xué)物對(duì)生殖發(fā)育影響干擾生殖發(fā)育任何步驟，并造成損害作用。能夠經(jīng)過(guò)對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)，尤其是對(duì)性腺作用，發(fā)生間接影響。神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)內(nèi)分泌功效也有調(diào)整作用，經(jīng)過(guò)下丘腦-垂體-睪丸軸(下丘腦-垂體-卵巢軸)兩條路徑作用于生殖發(fā)育過(guò)程。

概述生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第3頁(yè)外源化學(xué)物對(duì)生殖發(fā)育損害作用特點(diǎn)

生殖發(fā)育過(guò)程較機(jī)體其它系統(tǒng)更為敏感外源化學(xué)物對(duì)生殖發(fā)育過(guò)程影響范圍較為廣泛和深遠(yuǎn)

概述生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第4頁(yè)術(shù)語(yǔ)基本概念生殖毒理學(xué)(reproductivetoxicology)主要研究外源化學(xué)物對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)生、卵細(xì)胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳過(guò)程損害作用及其評(píng)定，評(píng)定方法即為生殖毒性試驗(yàn)。發(fā)育毒理學(xué)(developmentaltoxicology)主要研究外源化學(xué)物對(duì)胚胎發(fā)育、胎仔發(fā)育以及出生幼仔發(fā)育影響及其評(píng)定，評(píng)定方法稱為發(fā)育毒性試驗(yàn)，其中主要為致畸試驗(yàn)。

概述生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第5頁(yè)第二節(jié)生殖毒性及其評(píng)定

生殖毒理學(xué)歷史生殖毒性生殖毒性評(píng)價(jià)

生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第6頁(yè)生殖毒理學(xué)歷史1950年美國(guó)霍普金斯大學(xué)醫(yī)院發(fā)覺(jué)，懷孕期間服用黃體酮，先后有600多名女嬰出現(xiàn)生殖器男性化畸形。1956年用于治療妊娠反應(yīng)反應(yīng)停，1961年后出現(xiàn)近萬(wàn)例短肢畸形兒(海豹畸形)。二惡英(TCDD)造成大面積污染及其與人群生殖危害關(guān)系至今仍不清楚。

生殖毒性及其評(píng)定生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第7頁(yè)生殖毒理學(xué)歷史過(guò)去半個(gè)世紀(jì)震驚全球系列中毒或?yàn)?zāi)難事件發(fā)生，在世界范圍內(nèi)提升了人們對(duì)食品和藥品中危險(xiǎn)物質(zhì)安全意識(shí)，高度關(guān)注新化學(xué)物對(duì)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)或妊娠結(jié)局不良影響，促進(jìn)了與生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)安全相關(guān)法律產(chǎn)生和研究方法指南問(wèn)世。

生殖毒性及其評(píng)定生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第8頁(yè)生殖毒性

外源化學(xué)物對(duì)生殖過(guò)程損害作用能夠表現(xiàn)為性無(wú)能或各種形式性功效減退。雌性可出現(xiàn)排卵規(guī)律改變，經(jīng)期失調(diào)，卵巢萎縮，受孕降低，胚胎死亡，生殖能力降低不孕或不育等。雄性可表現(xiàn)為睪丸萎縮或壞死，精子數(shù)目降低。

生殖毒性及其評(píng)定生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第9頁(yè)生殖毒性評(píng)價(jià)

外源化學(xué)物對(duì)生殖過(guò)程作用評(píng)定主要經(jīng)過(guò)生殖毒性試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行。生殖毒性試驗(yàn)?zāi)軌蛉矫娣磻?yīng)外源化學(xué)物對(duì)性腺功效、交配行為、受孕、妊娠過(guò)程、分娩、授乳以及幼仔斷乳后生長(zhǎng)發(fā)育可能發(fā)生影響。

生殖毒性及其評(píng)定生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第10頁(yè)評(píng)定主要依據(jù)是交配后母體受孕情況（受孕率）、妊娠過(guò)程情況（正常妊娠率）、子代動(dòng)物分娩出生情況（出生存活率）、授乳培育（培育成活率）以及斷奶后發(fā)育情況等。是檢驗(yàn)外源化學(xué)物對(duì)動(dòng)物生育繁殖機(jī)能有沒(méi)有損害作用試驗(yàn)。

生殖毒性及其評(píng)定生殖毒性評(píng)價(jià)

生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第11頁(yè)生殖毒性試驗(yàn)普通是對(duì)成年動(dòng)物進(jìn)行染毒并試驗(yàn)，包含子代從生殖能力、受孕率、受精卵到性成熟全部發(fā)育階段，觀察期貫通一個(gè)完整生命周期，以檢測(cè)近、遠(yuǎn)期效應(yīng)。選擇各種方案關(guān)鍵在于試驗(yàn)對(duì)生殖和生長(zhǎng)發(fā)育各階段影響無(wú)間隔，并可直接或間接評(píng)價(jià)生殖循環(huán)循環(huán)全過(guò)程。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第12頁(yè)三段生殖毒性試驗(yàn)共同要求：動(dòng)物選擇：大鼠是嚙齒類首選動(dòng)物；最常使用非嚙齒類動(dòng)物是兔。應(yīng)選擇年輕、性成熟雄鼠與未交配過(guò)雌鼠。雄性大鼠最適交配日齡為90日，雌性大鼠為80日，小鼠最適交配日齡為65-80日。家兔小型品種性成熟3-4月齡，中型品種4-5月，大型5-6個(gè)月，最適交配日齡后推1個(gè)月。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第13頁(yè)動(dòng)物數(shù)：應(yīng)確保含有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，除畸胎、流產(chǎn)、全胎死亡等異常情況，嚙齒類和非嚙齒類動(dòng)物各選取16-20窩。時(shí)間：準(zhǔn)確查到精子或陰栓之日計(jì)為妊娠d0，仔鼠出生之日定為pd0。劑量選擇：依據(jù)基礎(chǔ)資料確定最高劑量，若資料不足應(yīng)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，高劑量組應(yīng)有輕微母體毒性劑量，但孕鼠死亡率不得高于10%。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第14頁(yè)母體毒性表現(xiàn)為：體重增加減緩或體重增加加緊，尤其是當(dāng)激素分泌受干擾時(shí)；特定靶器官毒性；血清學(xué)、臨床生化學(xué)異常；或過(guò)分毒性反應(yīng)。給藥路徑：要求與人類預(yù)期接觸和使用路徑相同，若有動(dòng)力學(xué)資料表明其它路徑合理性，如表現(xiàn)出相同體內(nèi)分布，也可作為次選路徑。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第15頁(yè)1對(duì)生殖能力及從早期胚胎發(fā)育到著床檢測(cè)從雌雄動(dòng)物交配前、交配期、直到著床期間進(jìn)行染毒產(chǎn)生毒性效應(yīng)或干擾。雌性動(dòng)物可檢測(cè)對(duì)雌激素周期、輸卵管運(yùn)輸、著床、著床前孕體發(fā)育影響。雄性動(dòng)物能夠檢測(cè)對(duì)生殖功效影響（精子成熟），而這些功效改變無(wú)法經(jīng)過(guò)雄性生殖器官組織學(xué)檢驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第16頁(yè)操作步驟動(dòng)物選擇及數(shù)量：最好大樹(shù)，提議16-20窩交配：交配百分比最好為1：1，交配過(guò)程應(yīng)確?？赏瑫r(shí)確認(rèn)各窩父母代動(dòng)物，交配期普通為2-3周。連續(xù)給藥其間：普通推薦交配前雄鼠給藥4周，雌鼠2周。染毒應(yīng)連續(xù)至雄性動(dòng)物交配結(jié)束后處死，而且最少到雌性動(dòng)物整個(gè)著床期，評(píng)價(jià)對(duì)雄性生殖和雌雄交配行為影響。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第17頁(yè)解剖：雌性動(dòng)物可在妊娠中期之后任意時(shí)間點(diǎn)解剖（第15天以后），雄性動(dòng)物可在交配后任意時(shí)間解剖，但在已能必定受孕成功后再解剖。觀察指標(biāo)：試驗(yàn)進(jìn)行中，天天統(tǒng)計(jì)相關(guān)癥狀及死亡，最少2次/周稱重及紀(jì)錄體重改變，交配期天天統(tǒng)計(jì)陰道分泌物以確定其是否交配及受試物對(duì)性周期影響及其它相關(guān)指標(biāo)。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第18頁(yè)試驗(yàn)終末指標(biāo)觀察全部成年動(dòng)物稱重后處死、尸解；對(duì)肉眼查見(jiàn)異常器官進(jìn)行組織學(xué)檢驗(yàn)，并保留對(duì)照組對(duì)應(yīng)器官；保留全部動(dòng)物生殖系統(tǒng)（睪丸、子宮、卵巢）供組織學(xué)檢驗(yàn)。精子計(jì)數(shù)及精子活動(dòng)能力。著床位置計(jì)數(shù)、活胎、死胎（吸收胎、晚死胎）計(jì)數(shù)。對(duì)表面看來(lái)未孕大、小鼠，用10%硫化銨進(jìn)行子宮染色15-20分鐘以確定是否有受精卵著床痕跡。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第19頁(yè)結(jié)果分析評(píng)價(jià)對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)胎兒應(yīng)以窩為單位；對(duì)親代資料，以個(gè)體或交配對(duì)為單位，應(yīng)考慮受影響窩百分比；每窩受影響胎仔組均百分率，受影響胎仔總數(shù)百分比。評(píng)價(jià)配子成熟，交配行為，孕體著床前發(fā)育、著床。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第20頁(yè)2對(duì)胚胎-胎兒發(fā)育影響研究目標(biāo)：檢測(cè)從著床到硬腭閉合期內(nèi)對(duì)雌性動(dòng)物連續(xù)染毒下，對(duì)受孕動(dòng)物和胚胎、胎兒發(fā)育有害影響。主要包含致死作用、生長(zhǎng)遲緩解結(jié)構(gòu)異常。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第21頁(yè)注意事項(xiàng)劑量設(shè)計(jì)與分組：劑量太大，產(chǎn)生胚胎毒作用大，結(jié)果引發(fā)較多死胎、吸收胎，甚至引發(fā)母鼠中毒死亡；劑量太小，低于致畸作用劑量，則又不引發(fā)畸形。普通設(shè)3個(gè)劑量組，最高劑量組應(yīng)有輕微母體毒性，最低劑量組不引發(fā)顯著毒性效應(yīng)。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第22頁(yè)試驗(yàn)終末指標(biāo)動(dòng)物處死后，馬上從腹中線解剖，稱量帶胎仔子宮重，計(jì)算第20天孕鼠重減去帶胎仔子宮重，再減去第6天體重后得到孕期增重，在解剖鏡下計(jì)算黃體數(shù)以確定排卵數(shù)，仔細(xì)觀察著床數(shù)，活胎、死胎。稱量每個(gè)胎兒體重，區(qū)分性別，然后從頭至腳觀察有沒(méi)有畸形。骨骼檢驗(yàn)、內(nèi)臟檢驗(yàn)。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第23頁(yè)結(jié)果分析和評(píng)價(jià)致畸指數(shù)（TI)=雌性動(dòng)物L(fēng)D50/最小致畸計(jì)量，表示致畸強(qiáng)度。致畸指數(shù)小于10為基本無(wú)致畸危害；致畸指數(shù)大于10為有致畸危害，大于100為強(qiáng)致畸危害。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第24頁(yè)相對(duì)致畸指數(shù)（RTI):成年動(dòng)物L(fēng)D01（最小致死劑量）與誘發(fā)5%畸形發(fā)生率劑量之比，比值越大，表示致畸度越高。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第25頁(yè)對(duì)圍生期發(fā)育及母體功效影響研究目標(biāo)：觀察從著床到斷奶期間染毒對(duì)母體妊娠、分娩、哺乳影響，和對(duì)孕體和幼仔發(fā)育影響。染毒時(shí)間：妊娠第6天到分娩后第20天出生后觀察指標(biāo)：分娩、培育、哺乳等情況，子代體重和身長(zhǎng)及其生長(zhǎng)、發(fā)育、出生胎、存活胎、死胎、畸形率、分娩后第21天存活率及功效檢測(cè)等。生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第26頁(yè)試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)受試動(dòng)物：性成熟大鼠、小鼠或家兔

劑量分組:普通設(shè)置三個(gè)劑量組（最少兩個(gè)劑量組）和一個(gè)對(duì)照組染毒路徑:動(dòng)物接觸受試物方法應(yīng)參考人類實(shí)際接觸路徑動(dòng)物數(shù):每組雌雄各16到20只，或雌16到20只，雄8到10只

生殖毒性及其評(píng)定生殖毒性評(píng)價(jià)

生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第27頁(yè)試驗(yàn)方案:三代兩窩

生殖毒性及其評(píng)定生殖毒性評(píng)價(jià)

F３bF３aF１bF２bF２aF１aF０（斷奶或出生８周）

給予受試物８到１２周第一次交配第二次交配觀察三個(gè)月，喂飼普通飼料，觀察其生長(zhǎng)發(fā)育情況

斷乳后給予受試物８到１２周觀察三個(gè)月，喂飼普通飼料，觀察其生長(zhǎng)發(fā)育情況

斷乳后給予受試物８到１２周生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第28頁(yè)

兩代一窩(和一代一窩)生殖試驗(yàn)

生殖毒性及其評(píng)定F２斷奶，檢驗(yàn)發(fā)育情況F２出生，每窩留８只幼仔F１交配斷奶，給予受試物F１（每窩選留幼仔８只，雌雄各半）第１６~１９周雌雄交配出生第８周給予受試物（F０）生殖毒性評(píng)價(jià)

生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第29頁(yè)觀察指標(biāo)：受孕率（％）:反應(yīng)雌性動(dòng)物生育能力以及雌性動(dòng)物受孕情況

正常分娩率（％）:反應(yīng)雌性動(dòng)物妊娠過(guò)程是否受到影響

幼仔出生存活率（％）:反應(yīng)雌性動(dòng)物分娩過(guò)程是否正常

幼仔培育成活率（％）:反應(yīng)雌性動(dòng)物授乳培育幼仔能力

性別比生于指數(shù)：受孕雌鼠/同籠雌鼠除上述指標(biāo)外，還應(yīng)該注意出生幼仔是否有畸形存在，對(duì)死亡幼仔應(yīng)進(jìn)行畸形檢驗(yàn)，可為下一步致畸試驗(yàn)提供參考

生殖毒性及其評(píng)定生殖毒性評(píng)價(jià)

生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第30頁(yè)生殖毒性試驗(yàn)特殊性毒性表現(xiàn)形式多樣性、延續(xù)性和滯后性動(dòng)物交配和分娩時(shí)間非同時(shí)性多層次分組（給藥組及檢測(cè)指標(biāo)亞組）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)多樣性窩效應(yīng)和窩大小不均一性數(shù)據(jù)采集、處理和分析準(zhǔn)確可靠性

計(jì)算機(jī)管理系統(tǒng)生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第31頁(yè)動(dòng)物分組

交配前計(jì)算機(jī)分組交配后計(jì)算機(jī)自動(dòng)分組確保較高動(dòng)物交配率和受孕率

人工分組交配結(jié)束前少許受精鼠

生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第32頁(yè)動(dòng)物臨床觀察

自備數(shù)據(jù)庫(kù)包含試驗(yàn)動(dòng)物絕大多數(shù)異常行為體征按發(fā)生部位、嚴(yán)重程度和連續(xù)時(shí)間描述屏幕提醒功效提升臨床觀察準(zhǔn)確性和可靠性生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第33頁(yè)仔鼠解剖觀察外觀、內(nèi)臟及骨骼畸形檢驗(yàn)項(xiàng)數(shù)據(jù)庫(kù)共存有800各種試驗(yàn)動(dòng)物常見(jiàn)畸形或變異名稱

國(guó)際試驗(yàn)動(dòng)物畸形分類術(shù)語(yǔ)為基準(zhǔn)采取三級(jí)分類系統(tǒng)作觀察和統(tǒng)計(jì)

·外觀、內(nèi)臟及骨骼（1級(jí)）

·身體部位（2級(jí)）

·臟器、脈管或骨骼（3級(jí)）生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第34頁(yè)生殖毒性試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析難點(diǎn)

窩效應(yīng)：同一窩胎鼠反應(yīng)比不一樣窩胎鼠反應(yīng)更為相同。胚胎/胎兒終點(diǎn)分析應(yīng)以窩為試驗(yàn)單位。以胎兒作為試驗(yàn)單位就不能考慮窩內(nèi)相關(guān)性，增加Ⅰ類錯(cuò)誤概率，降低實(shí)驗(yàn)有效性窩大小差異：每窩胎鼠數(shù)存在較大差異，以窩為試驗(yàn)單位不能考慮到窩大小差異。同時(shí)，窩大小差異還影響胎鼠出生時(shí)體重及出生后生長(zhǎng)與發(fā)育同時(shí)存在各種統(tǒng)計(jì)資料：連續(xù)性計(jì)量資料，計(jì)數(shù)資料，兩分類資料生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第35頁(yè)

妊娠期母鼠體重,增重及攝食量：Bartlett方差齊性檢驗(yàn),單原因方差分析,重復(fù)測(cè)量方差分析法分析母鼠妊娠期體重及攝食量改變趨勢(shì);方差不齊則進(jìn)行Kruskal-Willis非參數(shù)檢驗(yàn)?zāi)甘蠼慌渎?，受孕率和死亡率：?檢驗(yàn)基于窩分析:母體毒性指標(biāo)生殖毒性醫(yī)學(xué)知識(shí)專家講座第36頁(yè)基于窩分析:子代發(fā)育毒性指標(biāo)

黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)及仔代性別比單原因方差分析，Tukey檢驗(yàn)胎