免疫組化實驗課

試驗一試驗動物取樣、固定與保留（4課時）試驗室規(guī)章制度及試驗室安全講解學(xué)生分組分小組配置相關(guān)溶液：操作動物致死法及取材:操作細(xì)胞標(biāo)本制備：操作尸體解剖取材：講解活檢標(biāo)本取材：講解組織樣品固定：操作免疫組化實驗課第1頁試驗室規(guī)章制度及試驗室安全⑴熟悉你所使用化學(xué)物質(zhì)特征和潛在危害。⑵檢驗設(shè)備性能，充分考慮到使用設(shè)備不足。⑶工作中碰到疑問，及時請教技術(shù)責(zé)任人以及有豐富知識專業(yè)人員，不得盲目操作。⑷不得在試驗室儲備食品、吃食品、抽煙、使用化裝品以及清洗隱形眼鏡。不得將家眷、小孩、親友帶進(jìn)化學(xué)試驗室。⑸必須戴防護(hù)鏡，穿工作服，包含不露腳趾滿口鞋，長發(fā)必須束起。⑹熟悉在緊急情況下逃離路線和緊急疏散方法；清楚滅火器材、安全淋浴間、眼睛沖洗器位置、搶救電話。⑺保持試驗室門和走道通暢，最小化存放試驗室試劑數(shù)量，未經(jīng)允許禁止儲存劇毒藥品。⑻試驗必須在適當(dāng)通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行，密閉和有壓力試驗必須在特種試驗室進(jìn)行。⑼離開試驗室前須洗手，不可穿著試驗室服裝和戴手套進(jìn)入清潔場所，如餐廳和休息室等。⑽遇試劑溢出，應(yīng)該馬上去除。如溢出物有劇毒氣體揮發(fā)，當(dāng)事人無法處理，必須及時疏散人員并封閉現(xiàn)場，馬上匯報室主任和安全部門。⑾保持試驗室潔凈整齊，無堆積，天天最少清理一次試驗臺面，通常在下班前或完成某個特定試驗后進(jìn)行。⑿做試驗期間禁止脫崗。過夜試驗按所“過夜試驗管理方法”執(zhí)行。⒀及時按要求處理廢棄化學(xué)品，包含化學(xué)廢棄物、過期化合物、生物廢棄物。每七天在指定時間送往指定地點。⒁試驗室及禁煙區(qū)內(nèi)禁止吸煙，禁止吸游煙。禁止違章使用明火。⒂工作時間之外，任何人都不允許在試驗室單獨操作大型儀器和危險化學(xué)品，或單獨處于具潛在危險場所。免疫組化實驗課第2頁學(xué)生分組1學(xué)生分為6組，每組3個人，每組選一個小組長2安排值日生免疫組化實驗課第3頁分小組配置相關(guān)溶液1配制10XPBS及1XPBS10×PhosphateBufferedSolution（PBS）(pH7.4)：ReagentWeightFinalconcentrationNaClMW=58.4481.816g1.4MKClMW=74.552.01g27mMNa2HPO4·12H2OMW=358.1435.8g100mMKH2PO4MW=136.092.45g18mMH2OUpto1000ml注：1000ml溶液用約1ml10MNaOH調(diào)整pH值至7.4。因為試驗室所用蒸餾水、三蒸水和去離子水本底pH值有一定差異，加之NaOH可能因為放置時間而產(chǎn)生pH值改變，故實際用量需依據(jù)情況調(diào)整。免疫組化實驗課第4頁2配制1NHCl，1NNaOH3配制組織固定液：4%PFA4配制熱修復(fù)液：Tris-EDTA5配制梯度酒精：75%，85%，95%6酒精：二甲苯=1:17石蠟：二甲苯=1:1分小組配置相關(guān)溶液免疫組化實驗課第5頁動物致死法動物處死方法：

1.麻醉法乙醚或4％戊巴比妥靜注

2.空氣栓塞法

3.斷頭法

4.斷頸法

5.二氧化碳窒息法免疫組化實驗課第6頁

病人死亡后，普通要在數(shù)小時后才能做尸檢，所以，及時取材，盡早固定是開展IHC檢測關(guān)鍵。尸檢組織取材免疫組化實驗課第7頁免疫組化實驗課第8頁

抗原在組織中分布常不均一，取材時應(yīng)考慮：主要病灶，病灶與正常組織交界處，遠(yuǎn)離病灶正常組織。

組織大?。洪L1cm×寬1cm×厚0.2～0.3cm。手術(shù)切除標(biāo)本取材免疫組化實驗課第9頁

1.組織要求離體后30min內(nèi)浸入固定液，尤其是開展分子生物學(xué)工作。動物組織取材要求心臟還在跳動時取材。2.注意預(yù)防人為原因影響

刀和剪要快，刀要足夠長。

3.組織塊大小

厚為0.1～0.3cm，大小可依據(jù)需要而定

4.組織取材位置

要視研究目標(biāo)，觀察部位而定5.取材時間

標(biāo)準(zhǔn)上，應(yīng)盡快取材，但比較大手術(shù)標(biāo)本如胃、肺、腸等器官，最好先固定后取材。組織取材注意事項免疫組化實驗課第10頁

培養(yǎng)活細(xì)胞可分貼壁和懸浮二種。貼壁細(xì)胞可將

（1）細(xì)胞大量培養(yǎng)后，經(jīng)消化將細(xì)胞制成懸液（106）涂在涂有切片粘合劑載玻片上，涼干后固定。

（2）將細(xì)胞直接培養(yǎng)在蓋玻片上。

（3）將細(xì)胞直接培養(yǎng)在6孔或9孔板上，經(jīng)固定后可行IHC。活細(xì)胞標(biāo)本制備法免疫組化實驗課第11頁

目標(biāo)

(1)預(yù)防組織細(xì)胞死后改變，預(yù)防自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞固有形態(tài)。

(2)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有結(jié)構(gòu)與生活時相仿。（3）使組織中各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不一樣折射率，造成光學(xué)上差異，方便染色后易于判別和觀察。

（4）固定劑兼有硬化作用、使組織硬化、增加組織硬度、便于制片。（5）預(yù)防細(xì)胞過分收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。

（6）經(jīng)過固定組織能對染料產(chǎn)生不一樣親和力而著色清楚，便于識別。組織標(biāo)本固定免疫組化實驗課第12頁

(1)甲醛固定液

10％福爾馬林

(2)4％多聚甲醛固定液

(3)BouinS液及改良BouinS液

固定液種類免疫組化實驗課第13頁(1)大小2cm×2cm×0.3cm

(2)及時固定(3)固定時間固定時間要視組織塊厚薄，固定液種類及濃度，溫度而定，標(biāo)準(zhǔn)上，組織塊大小與固定時間成正比，固定液穿透力及濃度與固定時間成反比。

(4)組織固定后必須徹底沖洗。固定方法選擇及注意事項免疫組化實驗課第14頁試驗步驟組織取材與細(xì)胞制備。組織取材：小鼠子宮、淋巴結(jié)、胸腺、脾、骨髓。組織洗滌。將取到材料在滅菌預(yù)冷PBS中洗凈，盡可能徹底洗掉血液，以免切片觀察時紅細(xì)胞影響結(jié)果；組織固定。所取材料于4％多聚甲醛中固定24小時（固定時間依組織大小而定，組織較大可固定較長時間，假如一開始分小塊固定，則固定時間應(yīng)縮短，約6小時）；組織脫水。分別用50％和70％酒精脫水1h，樣品在70％酒精中置于4℃保留直至石蠟包埋；梯度脫水。組織塊從70％酒精中取出，在80％、95%、100％、100％酒精中各脫水1h；透明。組織塊在100％酒精/二甲苯（1:1）中透明30min；再到二甲苯中透明，詳細(xì)時間依據(jù)組織塊大小而定，以組織塊完全透明為宜；浸蠟。包埋機(jī)可直接接取加溫并過濾好石蠟液體，組織塊在二甲苯/石蠟(1:1)、石蠟、石蠟中各透蠟2h；免疫組化實驗課第15頁試驗完成整理試驗室及試驗臺免疫組化實驗課第16頁試驗二組織包埋與切片及HE染色（4課時）試驗內(nèi)容：1經(jīng)脫水，透明，浸蠟組織樣品進(jìn)行包埋：操作2包埋樣品切片：石蠟切片3切片HE染色：免疫組化實驗課第17頁目標(biāo)：

因為石蠟不溶于水和醇類試劑，只溶解在二甲苯類試劑中。因而,組織經(jīng)固定和水洗后含大量水分,需用乙醇類試劑進(jìn)行脫水,水脫完后,組織內(nèi)含有大量乙醇,還必須用能溶解乙醇二甲苯來置換,最終經(jīng)浸蠟,組織細(xì)胞內(nèi)被大量石蠟支撐,才使組織能用于石蠟切片。組織脫水、浸蠟及包埋免疫組化實驗課第18頁(1)脫水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、

Ⅲ乙醇，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

(2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ(3)浸蠟：石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ

(4)石蠟包埋：修蠟塊，標(biāo)號常規(guī)石蠟包埋過程免疫組化實驗課第19頁普通組織化學(xué)染色切片厚度要求在5～7μm左右，神經(jīng)組織切片厚度要求比較特殊，普通在20～100μm之間，方便觀察神經(jīng)纖維走行。對于不一樣組化反應(yīng)在切片制作上有不一樣要求。當(dāng)前切片技術(shù)主要有：冰凍切片、石蠟切片、超薄切片（電鏡學(xué)）。

組織切片免疫組化實驗課第20頁⑴驟冷（Quenching）驟冷目標(biāo)①最主要目標(biāo)是預(yù)防標(biāo)本內(nèi)水結(jié)成冰晶——破壞標(biāo)本結(jié)構(gòu)。②殺死組織（細(xì)胞）。③快捷制片。冰凍切片是酶組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)最慣用方法。它突出特點：能比很好地保留組織酶活性，較完好地保留組織抗原免疫活性。

冰凍切片免疫組化實驗課第21頁⑵切片驟冷后組織塊切片機(jī)上切片，當(dāng)前切片機(jī)有兩類：1）開放式冰凍切片機(jī)（半導(dǎo)體制冷切片機(jī)、

甲醇制冷切片機(jī)及傳統(tǒng)CO2、氯乙烷等切片機(jī)）。開放式冰凍切片機(jī)因為暴露于空氣中，溫度不易控制，技術(shù)難度大，現(xiàn)多已淘汰。2）恒溫冰凍切片機(jī)（Cryastat）——慣用

恒溫冰凍切片機(jī)切片后如不染色，必須冷風(fēng)吹干，貯存于低溫冰箱內(nèi)或短暫預(yù)固定后，冰箱貯存。

冰凍切片免疫組化實驗課第22頁LEICA冰凍切片機(jī)免疫組化實驗課第23頁石蠟切片LeicaRM2235RotaryMicrotome免疫組化實驗課第24頁免疫組化實驗課第25頁

(1)連續(xù)切片按序貼在玻片下1/3。

(2)52－60℃烤片。

(3)切片厚2～4μm。

(4)切片刀要快

(5)編上號

(6)切片可在4℃保留多年（石蠟切片）(7)冰凍切片后需涼干后馬上固定

(8)冰凍切片分固定和新鮮組織，固定組織需經(jīng)庶糖處理24h，冰凍切片。

(9)冰凍切片固定后-80℃保留備用切片要求及注意事項免疫組化實驗課第26頁包埋。在包埋盒底先鋪上一定厚度石蠟，置于熱臺，將組織用鑷子放入，調(diào)整好方向，將包埋盒置于涼臺，使底部略微凝固，繼續(xù)澆上石蠟，放上切片托，涼臺冷凍，澆蠟，冷凍，直至整個蠟塊成型。置于涼臺，待石蠟徹底凝固后，利用切片托將蠟塊取出。組織切片。把切片刀架上，固定緊，然后利用切片托將蠟塊在切片機(jī)固定器上夾緊。若位置不夠平，可調(diào)整切片臺位置，同時修塊。切片時，一開始能夠?qū)⒑穸日{(diào)整至20μm。右手勻速轉(zhuǎn)動手柄，直到把組織全部切出，這時將厚度調(diào)為5μm，繼續(xù)切片。蠟片切成后，右手用小鑷子攝蠟片，左手用毛筆沿刀鋒輕輕把蠟片分開，切面朝下把切片放入42℃水中，展平后用鑷子輕輕將連續(xù)蠟片分開，再用載玻片撈起，晾干，放入切片盒。37℃烤片過夜。石蠟包埋及切片試驗步驟免疫組化實驗課第27頁HE染色法，即是蘇木精-伊紅染色法。石蠟切片技術(shù)里慣用染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中成份著紅色。易于被堿性或酸性染料著色性質(zhì)分別稱為嗜堿性和嗜酸性；若于兩種染料親和力都不強(qiáng)，則稱中性。普通組織改變和組織產(chǎn)物都能夠經(jīng)過這一染色法顯示出來。是形態(tài)學(xué)最慣用染色方法。HE染色免疫組化實驗課第28頁HE染色步驟試劑時間×次數(shù)1二甲苯10min×32100％酒精5min×3395％酒精5min×1485％酒精5min×1570％酒精5min×1650％酒精5min×17蒸餾水5min×38蘇木精染液10min9自來水（緩流水）10min10蒸餾水2min×1111％HCl分色1-2s（浸入即取出）12自來水（緩流水）馬上沖凈13蒸餾水2min×1140.1％氨水

返藍(lán)2-2.5min15蒸餾水2min×11650％酒精5min×11770％酒精5min×11885％酒精5min×119伊紅染液20s2095％酒精

脫浮色5min×12195％酒精

5min×122100％酒精5min×323二甲苯10min×324二甲苯&封片劑封片25通風(fēng)櫥晾干4h或過夜免疫組化實驗課第29頁試驗三免疫組化染色（4課時）試驗內(nèi)容：1免疫組化原理2免疫組化操作免疫組化實驗課第30頁免疫組化原理抗原＋抗體（特異性）＋酶標(biāo)識抗體，經(jīng)過酶與底物作用生成有色反應(yīng)物，定位組織或細(xì)胞內(nèi)抗原一門技術(shù)。免疫組化實驗課第31頁設(shè)對照目標(biāo)是為了排除假陰性和假陽性。對照染色目標(biāo)免疫組化實驗課第32頁假陰性原因主要有：①組織處理不妥，抗原丟失過多或被遮蔽；②抗體失活、效價過低或稀釋度不適當(dāng)（主要指一抗，即特異性抗體）；③染色步驟遺漏及差錯，或顯色劑選擇、緩沖液pH和離子強(qiáng)度不妥等。免疫組化實驗課第33頁假陽性均系由各種原因造成非特異著色所致，原因主要有：①自發(fā)熒光或內(nèi)源酶等干擾；②抗體試劑不純(尤其是一抗）；③操作失誤，如污染、切片干枯或顯色劑操作不妥等；免疫組化實驗課第34頁對照染色大致可分為陽性組織對照、陰性組織及陰性試劑對照和本身對照四大類：對照種類及其選取目標(biāo)免疫組化實驗課第35頁陽性組織對照指用已證實含有靶抗原同源及不一樣源組織切片或細(xì)胞涂片與待檢試驗切片同時作一樣處理和免疫染色組織對照。正確結(jié)果應(yīng)展現(xiàn)陽性，目標(biāo)是為了證實所用免疫組化染色流程有效性，排除假陰性可能。對照種類及其選取目標(biāo)免疫組化實驗課第36頁陰性組織對照指用已證實不含靶抗原同時處理和免疫標(biāo)識染色組織對照。正確結(jié)果應(yīng)為陰性，目標(biāo)是除外假陽性。對照種類及其選取目標(biāo)免疫組化實驗課第37頁空白對照指以緩沖液（PBS、TBS等）取代第一抗體（主要，必要時還可做第二抗體及橋聯(lián)抗體空白取代），其它各步不變試劑對照染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。對照種類及其選取目標(biāo)免疫組化實驗課第38頁取代對照指以所用方法第一抗體同源動物正常血清，